Novas

Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
As células cancerosas desenvolveron varios mecanismos para superar o estrés celular e seguir progresando.A proteína quinase R (PKR) e o seu activador de proteínas (PACT) son os respondedores iniciais que monitorizan varios sinais de estrés que conducen á inhibición da proliferación celular e da apoptose.Non obstante, a regulación da vía PACT-PKR nas células cancerosas segue sendo moi descoñecida.Aquí, descubrimos que o ARN antisentido de aspartil tRNA sintetasa 1 (DARS-AS1) de ARN non codificante longo (ARNlnc) está directamente implicado na inhibición da vía PACT-PKR e promove a proliferación de células cancerosas.Usando o cribado funcional a gran escala do lncRNA asociado ao cancro CRISPRi 971, descubrimos que DARS-AS1 estaba asociado cunha proliferación de células cancerosas significativamente mellorada.Polo tanto, o knockout DARS-AS1 inhibe a proliferación celular e promove a apoptose das células cancerosas en varias liñas de células cancerosas in vitro e reduce significativamente o crecemento do tumor in vivo.Mecánicamente, DARS-AS1 únese directamente ao dominio de activación PACT e impide a interacción PACT-PKR, reducindo así a activación de PKR, a fosforilación de eIF2α e inhibindo a morte celular apoptótica.Clinicamente, DARS-AS1 exprésase amplamente en múltiples cancros, e a sobreexpresión deste lncRNA é indicativa dun mal prognóstico.Este estudo dilucida a regulación específica do cancro da vía PACT-PKR polo lncRNA DARS-AS1 e proporciona outro obxectivo para o prognóstico e o tratamento do cancro.
A capacidade de adaptarse ao estrés é unha característica importante da supervivencia e proliferación das células cancerosas.A rápida proliferación e as características metabólicas do cancro alcanzan un pico en microambientes duros (privación de nutrientes, hipoxia e pH baixo) que poden desencadear vías de sinalización da morte celular.A desregulación de xenes sensibles ao estrés como p535, proteínas de choque térmico 6, 7, KRAS8, 9 e HIF-110, 11, 12, 13 obsérvase con frecuencia no cancro, bloqueando así a apoptose e promovendo a supervivencia.
A proteína quinase R (PKR) é un importante sensor de estrés e unha subunidade quinase do factor de iniciación eucariota 2α (eIF2α), un regulador da tradución que vincula o estrés celular coa morte celular.A PKR identificouse orixinalmente como unha proteína antiviral pola detección dun ARN de dobre cadea estraño (ARNds).Tras a súa activación, a PKR fosforila eIF2α para inhibir a síntese de proteínas virais e celulares14,15,16.PACT (proteína activadora de PKR) identificouse como a primeira proteína activadora de PKR en ausencia de dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Mediante a interacción directa co PKR, o PACT transduce varias tensións (inanición sérica, tratamento con peróxido ou arsenito) ao PKR e ás vías de sinalización augas abaixo.Ademais da fosforilación de eIF2α, a activación de PKR mediada por PACT desencadea varios eventos asociados á resposta ao estrés, incluíndo o estado redox alterado a través da vía PI3K/Akt24, a comprobación de danos no ADN mellorada mediante p5325,26 e NF-κB27,28. Regula a transcrición, 29. Dado o seu papel crítico na resposta ao estrés, a proliferación, a apoptose e outros procesos celulares clave, PKR e PACT son obxectivos terapéuticos prometedores para moitas enfermidades, especialmente o cancro30,31,32,33.Non obstante, a pesar deste significado funcional e biolóxico pleiotrópico, a regulación da actividade PACT/PKR nas células cancerosas segue sendo esquiva.
Os lncRNA son transcricións de máis de 200 nucleótidos sen potencial de codificación de proteínas.Dado que os proxectos de secuenciación do xenoma completo identificaron miles de ARNlc,35,36 fixéronse moitos esforzos para dilucidar as súas funcións biolóxicas.Un crecente corpo de investigacións demostrou que os lncRNA están implicados en moitos procesos biolóxicos37, incluíndo a regulación da inactivación do cromosoma X38,39, a impresión40, a transcrición41,42, a tradución43 e mesmo o crecemento do cancro44,45,46,47.Estes estudos informaron de que moitos lncRNA están implicados na vía PACT/PKR.Un destes estudos mostrou que o lncRNA ASPACT inhibe a transcrición de PACT e aumenta a retención nuclear do ARNm de PACT.Outros estudos demostraron que o lncRNA nc886 únese ao PKR e inhibe a súa fosforilación49,50.Ata o momento, non se informou de que o lncRNA regule a activación de PKR mediada por PACT.
O ARN antisentido 1 de aspartil-ARNt sintetasa (DARS-AS1) identificouse como un lncRNA oncoxénico51,52,53,54.Mediante a regulación de miP-194-5p53, miP-12952 e miP-532-3p51, o DARS-AS1 demostrou que promove o crecemento de carcinoma de células renales de células claras, carcinoma de tiroides e carcinoma de pulmón non de células non pequenas, respectivamente.Tong e os seus colegas tamén descubriron que DARS-AS1 promove a progresión do mieloma mantendo a estabilidade do motivo de unión ao ARN da proteína 39 (RBM39).Non obstante, non se realizaron estudos sobre se este lncRNA está implicado na regulación da activación de PACT-PKR e na resposta ao estrés das células cancerosas.
Aquí, realizamos unha pantalla de perda de función a gran escala usando o sistema CRISPRi e determinamos que o lncRNA DARS-AS1 promove a proliferación de varios tipos de células cancerosas.Ademais, identificamos un mecanismo principal: DARS-AS1 únese directamente a PACT, inhibe a unión de PACT e PKR, impide a fosforilación de eIF2α, un substrato de PKR inferior e, finalmente, inhibe a morte celular apoptótica.En conclusión, o noso traballo revela o lncRNA DARS-AS1 como un regulador da vía PACT-PKR e unha diana potencial para o tratamento e o prognóstico do cancro.
Extensos estudos de perfís xenómicos identificaron centos de ARNlnc asociados co cancro.Porén, a súa función segue sendo moi descoñecida56.Para identificar candidatos prometedores de lncRNA implicados na progresión do cancro, realizamos unha pantalla de perda de función para reducir a proliferación na liña celular de cancro colorrectal SW620 usando o sistema CRISPRi (Fig. 1a).A característica única das liñas celulares de cancro de colon SW480 e SW620 é que se derivan de tumores primarios e secundarios nun só paciente.Isto proporciona unha comparación valiosa para estudar os cambios xenéticos na progresión do cancro de colon avanzado.Polo tanto, analizamos os transcriptomas das liñas celulares de cancro colorrectal (SW480 e SW620) mediante a secuenciación de ARN e recollemos algúns lncRNAs funcionais potenciais da literatura publicada.En base a estes resultados, deseñamos unha biblioteca de sgRNA agrupada que contén 7355 oligos de sgRNA dirixidos a 971 lncRNA asociados ao cancro e 500 oligos de sgRNA non dirixidos para un control negativo (datos suplementarios 1).
Representación esquemática do cribado mediante o sistema CRISPRi.b enriquecemento de ARNsg despois do cribado.A liña de puntos horizontal representa log2 (cambio de dobra) = ±0,58.A liña de puntos vertical indica o valor de p = 0,05.Os puntos negros representan sgRNA non obxectivo (designado como NC).Os puntos vermellos son sgRNAs dirixidos a DARS-AS1.Os puntos azuis son ARNsg dirixidos a LINC00205, un lncRNA oncoxénico descrito anteriormente.cambio de dobra = (lectura normalizada, día 17)/(lectura normalizada, día 0).c A caída do sgRNA DARS-AS1 inhibiu o crecemento celular.As barras de erro representan ± desviación estándar dos tres experimentos.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 Proba t de Student de dúas colas.d Expresión DARS-AS1 en tumores (conxunto de datos TCGA).em Expresión de DARS-AS1 en mostras normais e tumorais pareadas de pacientes con BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP e COAD, respectivamente (conxunto de datos TCGA).Os valores p obtivéronse mediante a proba t de Student de dúas colas pareadas.
Despois de construír o plásmido e empaquetar o lentivirus, transducimos a liña celular de cancro colorrectal dCas9-SW620 coa biblioteca anterior en catro experimentos independentes de infección.A multiplicidade de infección (MOI) para estas infeccións foi de 0,1 a 0,3, o que indica que cada célula só se pode transfectar cun sgRNA.Despois de 18 días de cultivo in vitro, o perfil de enriquecemento dos ARNsg diana diminuíu ou aumentou despois do cribado, mentres que o número de oligonucleótidos de control non dirixidos permaneceu relativamente inalterable en comparación co perfil de pre-cribado, o que indica que a nosa diana ten unha pantalla moi específica. biblioteca.Arroz.1b e táboa complementaria 1). LINC00205, que se informou anteriormente para promover o cancro de pulmón e a progresión do cancro de fígado58,59,60, foi filtrado (log2 (cambio de veces) <-0,58, valor p <0,05), confirmando a fiabilidade deste cribado (Fig. 1b). LINC00205, que se informou anteriormente para promover o cancro de pulmón e a progresión do cancro de fígado58,59,60, foi filtrado (log2 (cambio de veces) <-0,58, valor p <0,05), confirmando a fiabilidade deste cribado (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, previamente informado para promover a progresión do cancro de pulmón e cancro de fígado58,59,60, foi excluído (log2 (cambio de veces) <-0,58, p-valor <0,05), confirmando a robustez deste cribado (Fig. .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化））） 筛选 可靠性 ， ， ， <0,05） ， 证实 该 该 筛选 筛选 可靠性 可靠性 ， 该 证实 证实 筛选 筛选 筛选 筛选 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化））） 筛选 可靠性 ， ， ， <0,05） ， 证实 该 该 筛选 筛选 可靠性 可靠性 ， 该 证实 证实 筛选 筛选 筛选 筛选 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, previamente informado para promover a progresión do cancro de pulmón e fígado58,59,60, foi excluído (log2 (cambio de veces) <-0,58, p-valor <0,05), confirmando a robustez deste cribado (Fig. .1b).
Entre todos os lncRNAs probados, DARS-AS1 tamén foi cribado, cos tres oligonucleótidos de sgRNA afíns reducidos significativamente despois de 18 días de cultivo, o que suxire que a caída deste lncRNA resultou nunha redución da proliferación do cancro (Fig. 1b).Este resultado foi apoiado aínda máis pola análise MTS en células de cancro colorrectal que mostra que a taxa de crecemento das células derrubadas DARS-AS1 só se reduciu á metade en comparación coas células control (Figura 1c) e foi consistente cos informes anteriores de varios outros tipos de cancro.: cancro de ril de células claras, cancro de tiroide e cancro de pulmón de células non pequenas51,52,53,55.Non obstante, a súa función e mecanismos moleculares no cancro colorrectal seguen sen explorar.Polo tanto, escollemos este lncRNA para máis estudos.
Para estudar a expresión de DARS-AS1 en pacientes, analizamos exhaustivamente 10.327 mostras de tumores do proxecto Cancer Genome Atlas (TCGA).Os nosos resultados mostran que DARS-AS1 está moi expresado e está regulado significativamente en células sas nunha variedade de tumores, incluíndo o adenocarcinoma de colon (COAD), o carcinoma de células claras renales (KIRC) e o carcinoma de células papilares renales (KIRP)..Moi poucos (Fig. 1d e Fig. 1a, b complementario). A análise de mostras pareadas de tumores saudables confirmou ademais unha expresión significativamente maior de DARS-AS1 nos tumores de carcinoma urotelial de vexiga (BLCA), carcinoma de células claras renales (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC). , carcinoma de endometrio do corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular de fígado (LIHC), carcinoma de células papilares renales (KIRP) e adenocarcinoma de colon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) . A análise de mostras pareadas de tumores saudables confirmou ademais unha expresión significativamente maior de DARS-AS1 nos tumores de carcinoma urotelial de vexiga (BLCA), carcinoma de células claras renales (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC). , carcinoma de endometrio do corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular de fígado (LIHC), carcinoma de células papilares renales (KIRP) e adenocarcinoma de colon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) .A análise de mostras pareadas de tumores saudables tamén confirmou unha expresión significativamente maior de DARS-AS1 en tumores de carcinoma urotelial de vexiga (BLCA), carcinoma de células renales e renales de células claras (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma de endometrio do corpo útero (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular de fígado (LIHC), carcinoma de células papilares do ril (KIRP) e adenocarcinoma de colon (COAD) (valor p < 0,05) (Fig. 1e– m).配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 (lusc) 肿瘤 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（ucec） ， 肺腺癌 （luad） ， 肝肝 细胞癌 （liHc） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （（（（和结肠腺癌 和结肠腺癌 （（） （p 值 肾<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 、 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 ， ， 内膜 （（（（） 肺腺癌 肺腺癌 （） 肝肝 （（（（（（（（（（（（肾 （癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .A análise de mostras pareadas sans/tumorales apoiou aínda máis o papel de DARS-AS1 no carcinoma urotelial de vexiga (BLCA), carcinoma de células renales de células claras (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD) e carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expresión en carcinoma de corpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular (LIHC), carcinoma de células papilares renales (KIRP) e adenocarcinoma de colon (COAD) (valor p <0,05) (Figura 1e -m).En conxunto, estes resultados indican que DARS-AS1 está moi e moi expresado nunha variedade de cancros.
Dado que DARS-AS1 e DARS (o xene que codifica a cadea antisentido) comparten o mesmo promotor e están situados un ao carón do outro, deseñamos shRNA para derrubar específicamente a DARS-AS1 pero non a DARS (figuras complementarias 2a,b e táboa complementaria 2). .Ademais de SW620, tamén utilizamos outras tres liñas celulares que expresan altamente DARS-AS1 para estudar a eficacia e a función da eliminación do shRNA (táboa complementaria 3).Os nosos resultados indicaron que os tres shRNA desenvolvidos acadaron polo menos un 80% de eficiencia de derrumbe de DARS-AS1 con pouco efecto sobre a cantidade de ARNm de DARS (figuras complementarias 2c-f).Ademais, descubrimos que a caída de DARS-AS1 con estes ARNsh inhibiu significativamente o crecemento celular nas liñas celulares de cancro colorrectal SW620 (49,7%) e HCT116 (27,7%), a liña celular de cancro de mama MBA-MD-231 (53,4%).) e a liña celular de hepatoma HepG2 (redución do 92,7%), así como a súa capacidade para formar esferas non ancoradas (redución media de ~50,8%, 44,6%, 40,7% e 75,7% por liña celular) (Fig. 2a,b).En SW620, os resultados do ensaio de formación de colonias confirmaron ademais que o shRNA DARS-AS1 inhibiu significativamente a proliferación celular cunha diminución media de aproximadamente un 69,6% (Fig. 2c).
Efecto do shRNA de control e do shRNA DARS-AS1 na proliferación celular (a) e na formación de esferoides (b) en células SW620, HCT116, MBA-MD-231 e HepG2.c Efecto do shRNA de control e do ARNsh DARS-AS1 na formación de colonias en células SW620.Proliferación celular (d), formación de esferoides (e) e formación de colonias (f) de células SW620 que sobreexpresan DARS-AS1.Os datos mostrados son a media ± desviación estándar de tres experimentos.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 e *** p ≤ 0,001 mediante a proba t de Student de dúas colas.
Para complementar os estudos de perda de función, a continuación creamos células SW620 que sobreexpresaban DARS-AS1 (figura complementaria 2g).A sobreexpresión de DARS-AS1 aumentou significativamente o crecemento celular (1,8 veces), a formación de esferoides non ancorados (1,4 veces) e a formación de colonias (3,3 veces) nas células SW620 (Fig. 2d-f).Confirmamos este resultado usando outra liña celular que expresa DARS-AS1, A549.Esta proliferación celular mellorada debido á sobreexpresión de DARS-AS1 observouse aínda máis nas células A549 (figura complementaria 2h, i e táboa complementaria 3).En conxunto, estes estudos de ganancias e perdas demostran que DARS-AS1 promove a proliferación de células cancerosas in vitro.
Para explorar o mecanismo subxacente polo cal DARS-AS1 regula a proliferación celular, realizamos unha análise de ARN pull-down para identificar os seus potenciais socios de unión a proteínas.Os resultados da RT-qPCR mostraron que preto do 86,2% de DARS-AS1 está situado no citoplasma das células SW620 (figura complementaria 3a).O DARS-AS1 ou pseudoARN biotinilado transcrito in vitro foi entón incubado con lisados ​​de células SW620 seguidos da separación SDS-PAGE.A posterior tinción de prata mostrou que unha banda distinta (~ 38 kDa) estaba significativamente enriquecida en mostras de extracción DARS-AS1, pero non en mostras de ARN ficticio ou contas (Fig. 3a).Esta banda foi identificada como unha proteína activadora de PKR (PACT) por espectrometría de masas (MS) e confirmada por inmunotransferencia nas liñas celulares SW620, HCT116 e HepG2 (Fig. 3a, b).Tamén se investigou o enriquecemento de DARS e proteínas PACT relacionadas (PKR e TRBP) mediante análise de ARN mediante transferencia Western (WB).Os resultados indicaron que non se atopou ningunha interacción directa entre o ARN DARS-AS1 e estas tres proteínas (figura complementaria 3b).A interacción específica entre DARS-AS1 e PACT foi confirmada aínda máis pola análise de inmunoprecipitación de ARN (RIP), que demostrou que DARS-AS1 estaba significativamente enriquecido en anticorpos anti-PACT pero non en outros ARN de control (figura 3c).Para determinar se o DARS-AS1 interactúa directamente con PACT en ausencia de outros compoñentes celulares, realizouse un ensaio de interferometría de biocapa (BLI) in vitro utilizando PACT purificado.Inmobilizouse o DARS-AS1 ou ARN ficticio marcado con biotina en biosensores de estreptavidina (SA) e logo incubouse nun tampón cinético que contiña PACT 1 μM.Notablemente, PACT uniuse fortemente a DARS-AS1 (valor KD ~ 26,9 nM), pero non para imitar o ARN (figura 3d).En conxunto, estes resultados demostran unha interacción directa e unha alta afinidade entre DARS-AS1 e PACT.
A análise de extracción de ARN identificou que DARS-AS1 interactúa con PACT en células SW620.Arriba, tinción de prata de proteínas relacionadas.Realizáronse inmunotransferencias inferiores con anticorpos anti-PACT.b Realizouse a análise de ARN pull-down en células HCT116 (arriba) e HepG2 (inferior).O enriquecemento de PACT detectouse mediante inmunotransferencia.Realizáronse ensaios de inmunoprecipitación de ARNc (RIP) en células SW620 utilizando os anticorpos indicados.d As curvas de unión de PACT ao DARS-AS1 de lonxitude total ou ao ARN de control obtivéronse mediante interferometría de biocapa (BLI).O ARN foi inmobilizado nun biosensor de estreptavidina.Utilizouse 1 μM PACT para medir a asociación.O ensaio de extracción de ARN realizouse usando DARS-AS1 de lonxitude total biotinilado ou truncado (arriba).Inmunotransferencia que mostra PACT recibido (abajo).f PACT marcado purificado incubouse con DARS-AS1 biotinilado de lonxitude total ou truncou (como en e) para o ensaio RIP in vitro.O ARN extraído foi verificado por RT-qPCR.g A afinidade relativa dos diferentes fragmentos de ARN polo PACT obtívose mediante interferometría de biocapa.Para a análise utilizáronse ARN 100 nM e RAST 1 μM.h Realizáronse ensaios RIP in vitro utilizando PACT marcado intacto ou truncado purificado.O ARN extraído foi verificado por RT-qPCR.i Taxa de crecemento das células SW620 que sobreexpresan DARS-AS1, PACT ou ambos.j A sobreexpresión de DARS-AS1 de lonxitude total ou truncada en células SW620 tivo diferentes efectos no crecemento celular.k Detectouse a apoptose mediante inmunotransferencia con anticorpo anti-PARP.l A eliminación de DARS-AS1 induce a apoptose das células SW620 como mostra a citometría de fluxo.Os datos mostrados son a media ± desviación estándar de tres experimentos. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, mediante a proba t de Student de dúas colas. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, mediante a proba t de Student de dúas colas. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 mediante a proba t de Student de dúas colas. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 mediante a proba t de Student de dúas colas.
Despois xeramos tres fragmentos de ARN DARS-AS1 biotinilados mediante transcrición in vitro para identificar a rexión DARS-AS1 necesaria para a asociación PACT (Figura 3e).Os resultados da análise de ARN mostraron que cada fragmento era capaz de interactuar con PACT, pero a rexión 3′-terminal (384-768 nucleótidos marcados A3) mostraba máis de 1-384 nucleótidos marcados A1) (Fig. 3e).Observáronse resultados similares no ensaio RIP in vitro mediante PACT recombinante (figura 3f).En consonancia con estes resultados, os experimentos para unir fragmentos de ARN inmobilizados a PACT mediante BLI tamén mostraron que PACT ten unha maior afinidade por A3 (384-768 nt) (valor KD de aproximadamente 94,6 nM), mentres que case non ten enlaces con outras áreas.(Fig. 3d).
Tamén examinamos as rexións de unión asociadas en PACT.PACT contén tres dominios funcionais, dous dos cales son dominios conservados de unión ao ARN de dobre cadea (dsRBD) e un terceiro dominio (denominado D3) que actúa como activador das interaccións proteicas.Para examinar a capacidade de unión do lncRNA de cada dominio, elaboramos tres mutacións que eliminaron cada un dos tres dominios e realizamos un ensaio RIP in vitro.Os nosos resultados mostraron que a eliminación do terceiro dominio (D3) de PACT reduciu significativamente a súa interacción con DARS-AS1 (en 0,11 veces en comparación co PACT intacto) en comparación coas outras dúas mutacións (Fig. 3h), demostrouse que a liberación de D3 interactuou con DARS.-AC1.En conxunto, estes resultados suxiren que a interacción entre DARS-AS1 e PACT pode producirse principalmente a través do extremo 3' de DARS-AS1 e do dominio D3 de PACT.
Observamos que DARS-AS1 non tivo ningún efecto sobre a expresión de PACT e que PACT non tivo ningún efecto sobre DARS-AS1 (figura complementaria 3c).Despois examinamos o efecto da caída de PACT no crecemento celular.En contraste con DARS-AS1, as células relativas creceron 1,5-3 veces máis rápido cando PACT foi derrubado (figura complementaria 3d).Os resultados do ensaio de formación de colonias indicaron que as células formaron colonias de 2-3 veces despois do tratamento con shRNA con PACT (figura complementaria 3e).Para probar se DARS-AS1 regula a proliferación celular a través de PACT, xeramos células SW620 que sobreexpresaban PACT, DARS-AS1 ou ambos.A sobreexpresión de PACT mostrou unha inhibición significativa da proliferación celular (figura 3i).Aínda que a sobreexpresión de DARS-AS1 per se promoveu significativamente a proliferación celular, non houbo diferenzas significativas na taxa de crecemento das células que sobreexpresaban DARS-AS1 e PACT.Estes resultados suxiren que PACT pode contrarrestar o aumento da proliferación causada pola sobreexpresión de DARS-AS1.
Dado que as diferentes rexións de DARS-AS1 teñen diferentes capacidades de unión a PACT, investigamos a súa influencia relativa na proliferación celular por diferentes sobreexpresións de fragmentos de DARS-AS1.En comparación cos outros dous fragmentos, DARS-AS1 estaba sobreexpresado no extremo 3' (384-768 nt), a principal rexión relacionada co PACT en DARS-AS1, que tiña a maior capacidade de estimular a proliferación celular (Fig. 3j).Estes resultados indican unha correlación positiva entre a capacidade de unión e a función biolóxica de DARS-AS1.
Informeuse que PACT é unha proteína pro-apoptótica19.Polo tanto, investigamos o efecto de DARS-AS1 na apoptose.Como era de esperar, a caída de DARS-AS1 aumentou significativamente a escisión de PARP nas células SW620 e aumentou a proporción de células positivas de anexina V nas liñas celulares SW620, HCT116, HepG2 e MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f–h), o que indica que o efecto antiapoptótico de DARS-AS1 nas células cancerosas é oposto á función inductora da apoptose de PACT.En conxunto, estes resultados suxiren que o mecanismo da función oncoxénica DARS-AS1 pode ser a través da inhibición da función PACT.
A continuación, exploramos as implicacións funcionais da asociación DARS-AS1-PACT.Informeuse que PACT activa a PKR mediante a interacción directa, que posteriormente mellora a fosforilación de eIF2α, causando a deleción da tradución e a apoptose17.En primeiro lugar, examinamos se DARS-AS1 afecta á localización celular de PACT e PKR.A microscopía de fluorescencia confocal mostrou que PACT e PKR estaban altamente colocalizados en células SW620 cun coeficiente medio de correlación de Pearson de 0,72.Mentres tanto, a sobreexpresión de DARS-AS1 reduciu significativamente a co-localización de PACT e PKR (coeficiente medio de correlación de Pearson 0,61) (Figura 4a).Para investigar se DARS-AS1 podería modular a interacción PACT-PKR, realizamos un ensaio de co-inmunoprecipitación (co-IP) con anticorpo anti-PACT en lisados ​​de células SW620.PKR estaba moi enriquecido en anti-PACT en células control, mentres que a recuperación de PKR reduciuse significativamente nos lisados ​​das células que sobreexpresaban DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT e PKR marcados purificados usáronse para ensaios de unión a proteínas in vitro.En consecuencia, os que proporcionaron DARS-AS1 pero ningún ARN de control mostraron unha interacción PACT-PKR suprimida (figura 4c).Todos os resultados mostraron que DARS-AS1 interrompeu a comunicación PACT e PKR.
observouse unha co-localización de PACT e PKR en células control ou células que sobreexpresaban DARS-AS1 mediante microscopía de fluorescencia confocal.Os núcleos foron tinguidos con DAPI.Os resultados estatísticos obtivéronse de 16 fotografías.b Co-inmunoprecipitación (co-IP) usando anticorpos anti-PACT en lisados ​​celulares de células control SW620 ou células que sobreexpresan DARS-AS1.c Incubáronse PACT marcado, PKR purificado e transcrito in vitro con DARS-AS1 ou ARN simulado para a análise de unión a proteínas in vitro.Utilizáronse anticorpos anti-bandeira para a inmunoprecipitación.d Realizáronse inmunotransferencias cos anticorpos indicados en células SW620 e HCT116 transfectadas con shRNA de control ou DARS-AS1-shRNA seguidos de inanición sérica.Os niveis de expresión de DARS-AS1 alteraron a sensibilidade celular á thapsigargina.As células SW620 transfectáronse con ARNsh DARS-AS1, plásmido de sobreexpresión DARS-AS1 ou plásmido de control.As células foron tratadas con thapsigargin durante 48 horas e a viabilidade celular determinouse mediante o reactivo MTS.f Utilizáronse DARS-AS1 ou ARN ficticio transcrito in vitro e PACT purificado para o ensaio de activación in vitro e a detección de inmunotransferencia.g Realizáronse inmunotransferencias usando estes anticorpos en células SW620-ctrl (esquerda) ou células que sobreexpresaban mutantes PKR (dereita).Despois, estas células transfectáronse con shRNA de control ou DARS-AS1-shRNA seguido de inanición de soro.h A citometría de fluxo mostrou que a inactivación do mutante PKR compensou a apoptose inducida por DARS-AS1 nas células SW620.i Realizáronse inmunotransferencias cos anticorpos indicados en células SW620 (esquerda) ou HCT116 (dereita).As células transfectadas con shRNA control ou DARS-AS1 shRNA son privadas de soro e complementadas con inhibidor de PKR C16 ou DMSO 100 nM.Barra de escala = 5 µm.Os datos mostrados son a media ± desviación estándar de tres experimentos.* p ≤ 0,05 Proba t de Student de dúas colas.
En xeral, crese que unha vez que PACT interactúa con PKR17, pódese inducir a fosforilación de PKR en Thr451.Os nosos resultados indicaron que o nivel de fosforilación de PKR aumentou significativamente nas células de derrubamento DARS-AS1 despois da inanición do soro (figura 4d e figura complementaria 4a).En consecuencia, descubrimos que a fosforilación de eIF2α, o principal substrato de PKR, tamén aumentou significativamente o shRNA DARS-AS1 (figura 4d e figura complementaria 4a).A tapsigargina é un factor estresante do RE que fai que o RE libere Ca2+.O tratamento con thapsigargin induce a expresión e activación de PACT, que interactúa aínda máis co PKR e activa, o que leva á apoptose ao aumentar a fosforilación de eIF2α 18,61.Aquí, usamos a thapsigargina como estimulador da vía PACT/PKR para investigar se DARS-AS1 pode axudar ás células a superar o estrés inhibindo a vía PACT/PKR.Observamos que o nivel de expresión de DARS-AS1 correlacionouse positivamente coa resistencia das células á thapsigargina.As células SW620 que sobreexpresaban DARS-AS1 sobreviviron mellor cando se trataron con thapsigargin, mentres que as células con derrubamento DARS-AS1 volvéronse máis susceptibles (Fig. 4e).En consonancia con estes resultados, a sobreexpresión de DARS-AS1 reduciu a fosforilación de PKR inducida por thapsigargin (figura complementaria 4b).En cambio, despois do tratamento con thapsigargin, PKR e eIF2α foron fosforilados en maior medida nas células de derribo DARS-AS1 en comparación coas células control (Figura complementaria 4b).Curiosamente, a thapsigargin induciu a expresión DARS-AS1 de forma dependente da dose, o que pode indicar unha función antiestrés de DARS-AS1 (figura complementaria 4c).Ademais, realizamos ensaios de activación in vitro para confirmar estas observacións.Brevemente, PKR purificouse a partir de lisados ​​celulares usando un anticorpo anti-PKR, logo incubouse con PACT recombinante e DARS-AS1 transcrito in vitro.Despois da reacción enzimática, detectouse fosfo-PKR mediante WB.Os nosos resultados indicaron que a fosforilación de PKR foi inhibida significativamente por DARS-AS1, pero non polo ARN de control (Figura 4f).Estes resultados in vitro e in vivo suxiren que DARS-AS1 inhibe a activación de PKR mediada por PACT.Ao mesmo tempo, tamén observamos unha diminución na recuperación de PACT en presenza de DARS-AS1 (Figura 4f).Este resultado é consistente cos resultados do ensaio de unión a proteínas in vitro (figura 4c) e ilustra de novo a función de bloqueo de DARS-AS1 para a asociación PACT-PKR.
Ser246 e Ser287 no dominio D3 de PACT son necesarios para a activación de PKR baixo estrés celular.A substitución de dous residuos de serina por alanina deu PACT mutante (mutD), que activou PKR en ausencia de estrés, e a substitución por alanina (mutA) reverteu o protocolo.Dado que demostramos a importancia deste dominio en asociación directa con DARS-AS1, xeramos estes dous mutantes PACT para probar se estes residuos tamén poderían estar implicados na interacción con DARS-AS1.Curiosamente, ambos os mutantes perderon a capacidade de unirse a DARS-AS1 (figura complementaria 4d), o que suxire que a estrutura completa da proteína PACT pode ser necesaria para unha interacción eficiente con DARS-AS1.
Ademais, os nosos resultados tamén suxiren que a inhibición da proliferación celular inducida por DARS-AS1-shRNA pode restaurarse parcialmente mediante a sobreexpresión dun mutante PACT negativo dominante (PACTmutA) ou un mutante PKR negativo dominante (PKRmut) (Figura complementaria 4e. e).A sobreexpresión de mutantes PKR dominantes negativos reduciu a fosforilación de PKR inducida pola caída de DARS-AS1, así como a fosforilación de eIF2α en células privadas de soro (Fig. 4g).Máis importante aínda, a proporción de células apoptóticas inducidas pola caída de DARS-AS1 tamén se reduciu nas células que sobreexpresaban PKRmut (figura 4h e figura complementaria 4g).A inhibición da actividade da PKR quinase tamén prexudica a función de DARS-AS1, xa que os resultados mostraron que a caída de DARS-AS1 raramente desencadeaba a fosforilación de PKR e eIF2α cando as células eran tratadas cun inhibidor de C16 específico de PKR (figura 4i e figura complementaria 4h).).En conxunto, os nosos resultados suxiren que DARS-AS1 promove a proliferación celular, polo menos en parte, inhibindo a activación de PKR mediada por PACT.
Para explorar aínda máis o papel de DARS-AS1 na tumorigénesis, realizamos experimentos in vivo usando un modelo de xenoinjerto de rato. Os resultados mostran que a caída de DARS-AS1 diminuíu drasticamente o crecemento do tumor en ratos (valor p < 0,0001) (Fig. 5a). Os resultados mostran que a caída de DARS-AS1 diminuíu drasticamente o crecemento do tumor en ratos (valor p < 0,0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значерна 0.0015) (значера 0.00.15). Os resultados mostran que a caída de DARS-AS1 reduce drasticamente o crecemento do tumor en ratos (valor p < 0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a（图5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей у мышей (значительно снижает рост опухоли у мышей 01 (значительно)). Os resultados mostraron que a caída de DARS-AS1 reduciu significativamente o crecemento do tumor en ratos (valor p < 0,0001) (Figura 5a).Así, no grupo de eliminación DARS-AS1, houbo unha diminución significativa do volume medio do tumor nun 72,9% e da masa tumoral media dun 87,8% (Figura 5b-d).Estes resultados suxiren que DARS-AS1 pode promover significativamente o crecemento do tumor in vivo.
Efectos do derrubamento do anuncio DARS-AS1 na oncoxénese colorrectal en ratos desnudos.Móstranse as curvas de crecemento (a), o tamaño do tumor (b), o peso (c) e as imaxes do tumor (d).As barras de erro representan ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, mediante a proba t de Student de dúas colas. n = 10. ****p < 0,0001, mediante a proba t de Student de dúas colas. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 Proba t de Student de dúas colas.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 Proba t de Student de dúas colas.Kaplan-Meier analizou a correlación entre os niveis de expresión de DARS-AS1 e a supervivencia global en pacientes con UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM e LGG.Os altos niveis de expresión de DARS-AS1 en pacientes estaban no 50% superior;o baixo nivel de expresión de DARS-AS1 en pacientes estaba no 50% inferior.Os valores p determináronse mediante a proba de clasificación de rexistro.f Modelo proposto no que o DARS-AS1 regula a vía PACT-PKR e o crecemento do tumor.
Para comprender mellor o impacto clínico de DARS-AS1, examinamos a correlación entre a súa expresión e a supervivencia do paciente.Ao analizar o conxunto de datos do TCGA, descubrimos que unha maior expresión de DARS-AS1 estaba asociada con melanoma úveal (UVM), cromofobia renal (KICH), carcinoma de células papilares renales (KIRP), mesotelioma (MESO), múltiplex.A menor supervivencia asociouse significativamente coa morfose do glioblastoma (GBM) e os pacientes con glioma cerebral de baixo grao (LGG) (Figura 5e).Estes resultados suxiren que DARS-AS1 pode desempeñar un papel importante na progresión clínica do tumor e pode ser un potencial biomarcador preditivo en múltiples cancros.
Neste estudo, utilizando o cribado funcional CRISPRi a gran escala, determinamos que o lncRNA DARS-AS1 supera o estrés das células cancerosas ao regular dous respondedores clave do estrés, PACT e PKR.Ao interactuar directamente con PACT, DARS-AS1 inhibiu a activación de PKR mediada por PACT, evitando así a morte celular apoptótica e promovendo a proliferación celular (Fig. 5f).Observouse a regulación positiva de DARS-AS1 en múltiples tipos de cancro, o que suxire que a súa función de promover a supervivencia das células cancerosas en condicións estresantes pode ser amplamente aplicable a varios tipos de cancro.
PACT identificouse como unha proteína activadora de PKR, e a activación de PKR mediada por PACT xoga un papel importante nas respostas ao estrés ao regular a transcrición, tradución, apoptose e outros procesos celulares importantes62.Durante décadas, intentáronse comprender a regulación específica do cancro da cascada PACT-PKR.Aquí, o noso estudo revelou un mecanismo diferente de regulación de PACT-PKR en células cancerosas a través do lncRNA celular DARS-AS1, que se une directamente a PACT, bloquea a interacción PACT-PKR, inhibe a activación de PKR e a fosforilación de eIF2α, inhibindo así a apoptose inducida polo estrés e estimulando a eventual proliferación do cancro.células.Este descubrimento arroxa luz sobre posibles obxectivos de lncRNA para o prognóstico e a terapia do cancro.
Os nosos datos mostraron que a caída de DARS-AS1 sensibiliza ás células á inanición sérica cun aumento significativo da PKR fosforilada e eIF2α.Estes resultados suxiren que DARS-AS1 promove a supervivencia das células cancerosas en condicións duras ao inhibir a actividade PACT/PKR.Varios outros ARN non codificantes, como ASPACT e nc886, tamén están implicados no eixe PACT/PKR regulando á baixa o ARNm de PACT48 ou regulando a autofosforilación uníndose a PKR49,50,64.Entre eles, DARS-AS1 actúa como un disruptor da asociación PACT-PKR.Este estudo enriquece a nosa comprensión da regulación do eixe PACT/PKR e do papel dos lncRNAs nas respostas ao estrés.
PACT contén tres dominios separados.Cada un dos dous primeiros dsRBD é suficiente para lograr unha alta afinidade de unión de PACT a PKR, mentres que o terceiro dominio (D3) é necesario para a activación de PKR in vitro e in vivo.O noso estudo demostrou que DARS-AS1 interactúa preferentemente co dominio D3 (Fig. 3h).Dado o gran tamaño do lncRNA (768 nucleótidos), a unión de DARS-AS1 a D3 pode inhibir fisicamente a interacción entre o dominio PACT de dsRBD e PKR, bloqueando así a asociación de PACT e PKR.As mutacións puntuais PACT que substituíron a Ser246 e Ser287 en D3 por alanina ou aspartato interromperon a súa afinidade de unión por DARS-AS1, o que indica a importancia das propiedades estruturais e eléctricas xerais de D3 na súa asociación.No futuro serán necesarios máis detalles deste mecanismo, utilizando análises bioquímicas máis precisas e análise estrutural PACT de alta resolución.
Estudos anteriores informaron de que DARS-AS1 promove a proliferación celular a través de varios mecanismos51,52,53.Nun exemplo, os investigadores observaron que DARS-AS1 regulaba ao alza o seu xene DARS que codifica a proteína antisentido ao dirixirse a miP-194-5p en células cancerosas de ril.Non obstante, no presente estudo, a caída de DARS-AS1 tivo pouco efecto na transcrición de DARS en múltiples tipos de cancro, incluíndo polo menos os cancros colorrectal, de mama e de fígado.Debido a que os lncRNA presentan patróns de expresión específicos de células e tecidos, é posible que os mecanismos funcionais non se conserven entre os tipos de cancro, o que pode contribuír a esta discrepancia entre as nosas observacións e as avaliacións previas de diferentes cancros.Son necesarios estudos especiais para dilucidar os mecanismos específicos de diversos procesos fisiolóxicos e patolóxicos.
Unha análise de datos clínicos mostrou que a expresión de DARS-AS1 nos tumores está inversamente correlacionada coa supervivencia dos pacientes con cancro, o que subliña a importancia do eixe DARS-AS1/PACT/PKR no prognóstico do cancro.En conclusión, o noso estudo mostra que DARS-AS1 é un regulador do eixe de sinalización PACT/PKR, promove a proliferación de células cancerosas e inhibe a apoptose durante a resposta ao estrés, o que proporciona outra liña de investigación e é de interese para futuras investigacións sobre posibles tratamentos. .
As liñas celulares humanas SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 e HEK293T obtivéronse da National Cell Line Resource Infrastructure en China.Todas as células mantivéronse en medio DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) complementado con 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) e 1% penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher Scientific) a 37 ° C, 5% CO2.incubadora.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-bandeira, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fósforo S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fósforo S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);IgG normal de rato, CST (5415S);IgG normal de coello, CST (2729S).Os anticorpos diluíronse 1:1000 en PBST para Western blotting e 1:100 para IP.
Os sgRNA desenvolvéronse mediante unha ferramenta dispoñible para o público chamada CRISPR-ERA66.Usamos os parámetros predeterminados da ferramenta para o desenvolvemento de sgRNA e o algoritmo calculou os sitios de unión de sgRNA na rexión de 3 kb.centrado en TSS.Sintetizáronse grupos de oligonucleótidos de sgRNA en CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) e clonáronse en plásmidos de pgRNA humanizados (Addgene #44248).Un total de 12 µg de plásmido pgRNA humanizado agrupado, 7,2 µg de psPAX2 (Addgene #12260) e 4,8 µg de pMD2.G (Addgene #12259) foron co-transfectados en 5 x 106 HEK293T en reactivos de transfección de ADN de 10 cm. células (CWBIO, Beijing, China) seguindo as instrucións do fabricante.Os sobrenadantes que conteñen virus recolléronse 48 e 72 horas despois da transfección e filtráronse a través dun filtro de 0,45 µm.Para o cribado, obtivéronse células SW620 que expresan a proteína de fusión dCas9/KRAB mediante transdución de virus.As células SW620 modificadas infectáronse coa biblioteca de virus en catro experimentos independentes de infección cun MOI de 0,1-0,3 e mostráronse con 2 μg/ml de puromicina (Sigma, St. Louis, MO) durante 2 días.Despois diso, as células cultiváronse durante 18 días in vitro cunha cobertura mínima da biblioteca de 500 células/sgRNA para a selección.
O ADN xenómico extraeuse segundo as instrucións do kit QIAamp DNA Blood Midi (QIAGEN, Düsseldorf, Alemaña; 51183).En total, utilizáronse 100 μg de ADN xenómico por repetición biolóxica para construír a biblioteca.A rexión sgRNA foi amplificada por dúas roldas de PCR e ligouse a un código de barras.
Os produtos de PCR purificáronse mediante o xel NucleoSpin® e o kit de purificación de PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemaña; 740609.250) e cuantificáronse mediante o kit de detección de ADN de dobre cadea Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
O ensaio MTS utilizouse para medir a proliferación celular.As células sementáronse en placas de 96 pocillos cunha densidade inicial de 2000 células/pozo.O número relativo de células mediuse diariamente á hora indicada durante un total de 4-6 días.Para cada pozo, diluíronse 20 μl de reactivo MTS (Promega) con 100 μl de DMEM, incubáronse coas células durante 4 h a 37 °C e, a continuación, mediuse a OD490.
A capacidade de crecemento non ancorado foi descuberta analizando a formación de esferas.Brevemente, 2000 células transfectadas con shRNA DARS-AS1 ou control shRNA cultiváronse en microplacas de unión ultra baixa (Corning) cun cambio de medio cada 4 días.Os esferoides foron contados despois de 14 días.Utilizáronse 500 células transfectadas co plásmido de sobreexpresión DARS-AS1 ou cun plásmido de control para o ensaio de mellora, se non, o método non cambiou.
O ARN foi transcrito usando ARN polimerase T7 e biotina-16-UTP (Roche 1138908910) segundo as instrucións de Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Os cebadores usados ​​aquí están listados na táboa complementaria 4.
As rexións PACT ou PKR que codifican proteínas clonáronse en pET15b (Addgene #73619) e transformáronse en BL21(DE3).As bacterias incubáronse durante a noite en LB subministrado con ampicilina e despois diluíronse 100 veces con LB fresco.Cando a OD600 do medio chegou a 0,8, engadiuse 1 mM de IPTG para inducir a expresión da proteína.Despois da incubación durante a noite con axitación suave (250 rpm a 20 ° C), o sedimento celular foi recollido por centrifugación (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Resuspender o sedimento celular en tampón de lise (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, PMSF 1 mM) e incubar en xeo durante 30 min, despois sonicar (15 min, 5 s on/off, en xeo) e centrifugar (13.000 rpm)., 30 min, 4°С).O sobrenadante foi entón cargado sobre resina Ni-NTA (QIAGEN) 3 veces a 4 °C, lavado 4 veces con tampón de lavado (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) e eluído 3 veces, cun total de 10 ml de tampón eluyente (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazol 300 mM).A proteína purificada determinouse mediante WB e a concentración determinouse mediante o kit de ensaio de proteínas Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Os ensaios RIP realizáronse como se describiu anteriormente, con modificacións.Brevemente, 1 tampón RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lisa cóctel citostático 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) e centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min a 4 °C.O sobrenadante foi entón incubado con perlas magnéticas de proteína A+G (Millipore) conxugada con 5 μg de anticorpo anti-PACT (Abeam) ou IgG (CST).As esferas laváronse 5 veces con tampón RIP 5x e despois dixeríronse con proteinase K (NEB).O ARN foi extraído con Trizol e determinado por RT-qPCR.Os cebadores preséntanse na táboa complementaria 5.
O ensaio RIP in vitro realizouse segundo un protocolo de ensaio RIP estándar modificado.Un total de 5 pmol de ARN transcrito in vitro foron diluídos 1x con tampón RIP e recocidos mediante incubación a 65 °C durante 5 minutos seguido de arrefriamento lento a temperatura ambiente.Purificáronse un total de 5 pmol de proteínas PACT marcadas con bandeira intactas ou mutadas de E. coli.Incubar con ARN renaturalizado durante 2 horas a 4 °C e siga o procedemento anterior para a análise RIP para IP anti-bandeira.
Para a análise da extensión de ARN, lisáronse 1 × 107 células con tampón 1xRIP.Despois da centrifugación a 13.000 rpm durante 15 min a 4 °C, o sobrenadante foi pretratado con 30 μl de perlas magnéticas de estreptavidina (Beckman) durante 2 h a 4 °C.O lisado purificado foi entón subministrado con ARNt de levadura e incubouse con 40 pmol de ARN renaturalizado durante a noite a 4 ° C, despois durante outras 2 horas e engadíronse 20 μl de novas perlas magnéticas de estreptavidina bloqueadas con BSA.O paso de lavado consistiu en 4 veces con 5x tampón RIP e 4 veces con 1x tampón RIP.As proteínas correspondentes eluíronse con tampón de elución de biotina (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, D-biotina 12,5 mM, PMSF) e separáronse en NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Despois da tinción con prata (Beyotime Biotechnology), certas bandas foron extirpadas e analizadas por MS.
Realizouse a análise Co-IP para probar a interacción entre PACT e PKR.Brevemente, os lisados ​​sobrenadantes preparáronse incubando 1 x 107 células lisadas en 1 x tampón RIP seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C.Os lisados ​​cargáronse con perlas magnéticas de proteína A + G, conxugáronse con 5 µg de anticorpo anti-PACT e xiráronse suavemente durante a noite a 4 °C.As perlas laváronse 3 veces con tampón 5xRIP, dúas veces con tampón 1xRIP e eluíronse con tampón SDS 1x.A proteína recuperada analizouse mediante xel SDS-PAGE e detectouse mediante WB.
Dous pmol de PACT marcado e 1 pmol de PKR purificáronse de E. coli.Dilúese en tampón RIP 1 × e incube con 10 pmol de ARN renaturalizado durante 2 horas a 4 °C.Despois diso, incubáronse con anticorpo anti-marcado conxugado con perlas magnéticas de proteína A+G durante dúas horas máis.A continuación, lavaron as perlas catro veces con tampón RIP 1x e eluíronse con tampón SDS 1x.O PACT e PKR resultantes foron detectados por WB.