Novas

Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Os fotosensibilizadores eficaces son especialmente importantes para o uso clínico xeneralizado da fototerapia.Non obstante, os fotosensibilizadores convencionais adoitan sufrir unha absorción de lonxitude de onda curta, unha fotoestabilidade insuficiente, un baixo rendemento cuántico de especies reactivas de osíxeno (ROS) e unha extinción de ROS inducida pola agregación.Aquí informamos dun fotosensibilizador supramolecular (RuDA) de infravermello próximo (NIR) mediado pola autoensamblaxe de complexos organometálicos de Ru (II)-areno en solución acuosa.RuDA só pode xerar osíxeno singlete (1O2) no estado agregado, e presenta un comportamento de xeración de 1O2 inducido pola agregación evidente debido a un aumento significativo no proceso de cruzamento entre o sistema singlete-triplete.Baixo a acción da luz láser de 808 nm, RuDA presenta un rendemento cuántico de 1O2 do 16,4% (verde de indocianina aprobado pola FDA: ΦΔ=0,2%) e unha alta eficiencia de conversión fototérmica do 24,2% (nanobaras de ouro comerciais) cunha excelente fotoestabilidade.: 21,0 %, nanoconchas de ouro: 13,0 %).Ademais, os RuDA-NP cunha boa biocompatibilidade poden acumularse preferentemente nos sitios do tumor, causando unha regresión tumoral significativa durante a terapia fotodinámica cunha redución do 95,2% do volume do tumor in vivo.Esta terapia fotodinámica que mellora a agregación proporciona unha estratexia para desenvolver fotosensibilizadores con propiedades fotofísicas e fotoquímicas favorables.
En comparación coa terapia convencional, a terapia fotodinámica (PDT) é un tratamento atractivo para o cancro debido ás súas vantaxes significativas como o control espazo-temporal preciso, a non invasión, a resistencia insignificante aos medicamentos e a minimización dos efectos secundarios 1,2,3.Baixo irradiación luminosa, os fotosensibilizadores utilizados pódense activar para formar especies de osíxeno altamente reactivas (ROS), que provocan apoptose/necrose ou respostas inmunitarias4,5. Non obstante, a maioría dos fotosensibilizadores convencionais, como os cloros, as porfirinas e as antraquinonas, teñen unha absorción de lonxitude de onda relativamente curta (frecuencia < 680 nm), polo que resulta unha mala penetración da luz debido á intensa absorción de moléculas biolóxicas (por exemplo, hemoglobina e melanina) a rexión visible6,7. Non obstante, a maioría dos fotosensibilizadores convencionais, como os cloros, as porfirinas e as antraquinonas, teñen unha absorción de lonxitude de onda relativamente curta (frecuencia < 680 nm), polo que resulta unha mala penetración da luz debido á intensa absorción de moléculas biolóxicas (por exemplo, hemoglobina e melanina) a rexión visible6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Non obstante, os fotosensibilizadores máis comúns, como os cloros, as porfirinas e as antraquinonas, teñen unha absorción de lonxitude de onda relativamente curta (< 680 nm), o que resulta nunha mala penetración da luz debido á intensa absorción de moléculas biolóxicas (por exemplo, hemoglobina e melanina) na rexión visible6,7.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉 和 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 （（频率 频率 频率 蛋白 蛋白 和） ， 由于 对 对 生物 生物 生物 分子 （如 如 血红 蛋白 蛋白 如 如 如 （导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， ， 具有 相对 短 的 波长 吸收 （频率 频率 频率 频率 频率 频率） 的 的 的 ，）） 由于 分子 （（（血红 和 和））） ， （吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI 导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Non obstante, a maioría dos fotosensibilizadores tradicionais, como os cloros, as porfirinas e as antraquinonas, teñen unha absorción de lonxitude de onda relativamente curta (frecuencia < 680 nm) debido á forte absorción de biomoléculas como a hemoglobina e a melanina, que produce unha escasa penetración da luz.Área visible 6.7.Polo tanto, os fotosensibilizadores absorbentes do infravermello próximo (NIR) que se activan na "xanela terapéutica" de 700-900 nm son moi axeitados para a fototerapia.Dado que a luz infravermella próxima é a que menos absorben os tecidos biolóxicos, pode levar a unha penetración máis profunda e a menos danos fotográficos8,9.
Desafortunadamente, os fotosensibilizadores de absorción de NIR existentes xeralmente teñen unha fotoestabilidade deficiente, unha baixa capacidade de xeración de osíxeno singulete (1O2) e unha extinción de 1O2 inducida pola agregación, o que limita a súa aplicación clínica10,11.Aínda que se fixeron grandes esforzos para mellorar as propiedades fotofísicas e fotoquímicas dos fotosensibilizadores convencionais, ata agora varios informes informaron de que os fotosensibilizadores que absorben NIR poden resolver todos estes problemas.Ademais, varios fotosensibilizadores demostraron ser prometedores para a xeración eficiente de 1O212,13,14 cando se irradian con luz por encima de 800 nm, xa que a enerxía dos fotóns diminúe rapidamente na rexión próxima ao IR.Trifenilamina (TFA) como doador de electróns e [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazina (TDP) como grupo aceptor de electróns Colorantes de tipo doador-aceptor (DA). de colorantes , que absorben o infravermello próximo, que foron amplamente estudados para a bioimaxe II e a terapia fototérmica (PTT) no infravermello próximo debido á súa estreita brecha de banda.Así, os colorantes tipo DA pódense usar para a PDT con excitación case IR, aínda que raramente se estudaron como fotosensibilizadores para a PDT.
É ben sabido que a alta eficiencia do cruce intersistema (ISC) dos fotosensibilizadores favorece a formación de 1O2.Unha estratexia común para avanzar no proceso ISC é mellorar o acoplamento espín-órbita (SOC) dos fotosensibilizadores introducindo átomos pesados ​​ou restos orgánicos especiais.Non obstante, este enfoque aínda ten algunhas desvantaxes e limitacións19,20.Recentemente, a autoensamblaxe supramolecular proporcionou un enfoque intelixente ascendente para a fabricación de materiais funcionais a nivel molecular,21,22 con numerosas vantaxes na fototerapia: (1) os fotosensibilizadores autoensamblados poden ter o potencial de formar estruturas de cinta.Similar ás estruturas electrónicas cunha distribución máis densa dos niveis de enerxía debido á superposición de órbitas entre os bloques de construción.Polo tanto, mellorarase a coincidencia enerxética entre o estado excitado de singlete inferior (S1) e o estado excitado de triplete veciño (Tn), o que é beneficioso para o proceso ISC 23, 24 .(2) A montaxe supramolecular reducirá a relaxación non radiativa baseada no mecanismo de limitación do movemento intramolecular (RIM), que tamén promove o proceso ISC 25, 26.(3) O conxunto supramolecular pode protexer as moléculas internas do monómero da oxidación e degradación, mellorando así moito a fotoestabilidade do fotosensibilizador.Dadas as vantaxes anteriores, cremos que os sistemas fotosensibilizadores supramoleculares poden ser unha alternativa prometedora para superar as deficiencias da PDT.
Os complexos baseados en Ru(II) son unha plataforma médica prometedora para potenciais aplicacións no diagnóstico e terapia de enfermidades debido ás súas propiedades biolóxicas únicas e atractivas28,29,30,31,32,33,34.Ademais, a abundancia de estados excitados e as propiedades fotofísicoquímicas sintonizables dos complexos baseados en Ru(II) proporcionan grandes vantaxes para o desenvolvemento de fotosensibilizadores baseados en Ru(II)35,36,37,38,39,40.Un exemplo notable é o complexo polipiridilo de rutenio (II) TLD-1433, que se atopa actualmente en ensaios clínicos de Fase II como fotosensibilizador para o tratamento do cancro de vexiga non invasivo muscular (NMIBC)41.Ademais, os complexos organometálicos de rutenio(II)areno son moi utilizados como axentes quimioterapéuticos para o tratamento do cancro debido á súa baixa toxicidade e á súa facilidade de modificación42,43,44,45.As propiedades iónicas dos complexos organometálicos de Ru(II)-areno non só poden mellorar a escasa solubilidade dos cromóforos DA en disolventes comúns, senón tamén mellorar a ensamblaxe dos cromóforos DA.Ademais, a estrutura semi-sándwich pseudooctaédrica dos complexos organometálicos de Ru(II)-arenos pode previr estericamente a agregación de H dos cromóforos de tipo DA, facilitando así a formación de agregación J con bandas de absorción desprazadas ao vermello.Non obstante, as desvantaxes inherentes dos complexos Ru(II)-areno, como a baixa estabilidade e/ou a biodisponibilidade escasa, poden afectar á eficacia terapéutica e á actividade in vivo dos complexos areno-Ru(II).Porén, os estudos demostraron que estas desvantaxes poden superarse encapsulando complexos de rutenio con polímeros biocompatibles mediante encapsulación física ou conxugación covalente.
Neste traballo, informamos de complexos de Ru(II)-areno (RuDA) conxugados con DA cun disparador NIR mediante un enlace de coordinación entre o cromóforo DAD e o resto Ru(II)-areno.Os complexos resultantes poden autoensamblarse en vesículas metalosupramoleculares na auga debido a interaccións non covalentes.Notablemente, o conxunto supramolecular dotou RuDA con propiedades de cruce intersistema inducidas pola polimerización, o que aumentou significativamente a eficiencia ISC, o que foi moi favorable para a PDT (Fig. 1A).Para aumentar a acumulación de tumores e a biocompatibilidade in vivo, utilizouse Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) aprobado pola FDA para encapsular RuDA47,48,49 para crear nanopartículas RuDA-NP (Figura 1B) que actuaron como PDT/Dual- modo proxy PTT.Na fototerapia do cancro (Figura 1C), RuDA-NP utilizouse para tratar ratos espidos con tumores MDA-MB-231 para estudar a eficacia da PDT e PTT in vivo.
Ilustración esquemática do mecanismo fotofísico de RuDA en formas monoméricas e agregadas para a fototerapia do cancro, síntese de B RuDA-NPs e C RuDA-NPs para PDT e PTT activados por NIR.
RuDA, que consiste en funcionalidades TPA e TDP, preparouse segundo o procedemento que se mostra na Figura 1 complementaria (Figura 2A) e RuDA caracterizouse por espectros de RMN 1H e 13C, espectrometría de masas de ionización por electrospray e análise elemental (Figuras complementarias 2-4). ).O mapa de diferenzas de densidade de electróns RuDA da transición de singlete máis baixa calculouse mediante a teoría funcional da densidade dependente do tempo (TD-DFT) para estudar o proceso de transferencia de carga.Como se mostra na figura complementaria 5, a densidade de electróns deriva principalmente da trifenilamina á unidade aceptora de TDP despois da fotoexcitación, que se pode atribuír a unha transición típica de transferencia de carga intramolecular (CT).
Estrutura química do mineral B Espectros de absorción do mineral en mesturas de varias proporcións de DMF e auga.C Valores de absorción normalizados de RuDA (800 nm) e ICG (779 nm) en función do tempo a 0,5 W cm-2 de luz láser de 808 nm.D A fotodegradación de ABDA indícase pola formación de 1O2 inducida por RuDA en mesturas de DMF/H2O con diferentes contidos de auga baixo a acción da radiación láser cunha lonxitude de onda de 808 nm e unha potencia de 0,5 W/cm2.
Resumo: utilizouse a espectroscopia de absorción UV-visible para estudar as propiedades de autoensamblaxe do mineral en mesturas de DMF e auga en varias proporcións.Como se mostra na fig.2B, RuDA presenta bandas de absorción de 600 a 900 nm en DMF cunha banda de absorción máxima a 729 nm.O aumento da cantidade de auga levou a un desprazamento gradual ao vermello do máximo de absorción de mineral ata os 800 nm, o que indica a agregación J de mineral no sistema ensamblado.Os espectros de fotoluminiscencia de RuDA en diferentes disolventes móstranse na figura complementaria 6. RuDA parece presentar unha luminiscencia NIR-II típica cunha lonxitude de onda de emisión máxima de aprox.1050 nm en CH2Cl2 e CH3OH, respectivamente.O gran desprazamento de Stokes (uns 300 nm) de RuDA indica un cambio significativo na xeometría do estado excitado e a formación de estados excitados de baixa enerxía.Os rendementos cuánticos de luminiscencia do mineral en CH2Cl2 e CH3OH determináronse en 3,3 e 0,6%, respectivamente.Non obstante, nunha mestura de metanol e auga (5/95, v/v), observouse un lixeiro desprazamento ao vermello da emisión e unha diminución do rendemento cuántico (0,22%), que pode deberse á autoensamblaxe do mineral. .
Para visualizar a autoensamblaxe do ORE, utilizamos a microscopía de forza atómica líquida (AFM) para visualizar os cambios morfolóxicos do ORE en solución de metanol despois de engadir auga.Cando o contido de auga estaba por debaixo do 80%, non se observou ningunha agregación clara (figura complementaria 7).Non obstante, cun aumento adicional do contido de auga ata o 90-95%, apareceron pequenas nanopartículas, o que indicaba a autoensamblaxe de Ore. Ademais, a irradiación con láser cunha lonxitude de onda de 808 nm non afectou a intensidade de absorción de RuDA en augas acuosas. solución (Fig. 2C e Fig. 8 complementaria).Pola contra, a absorbancia do verde de indocianina (ICG como control) baixou rapidamente a 779 nm, o que indica unha excelente fotoestabilidade de RuDA.Ademais, a estabilidade dos RuDA-NPs en PBS (pH = 5,4, 7,4 e 9,0), 10% FBS e DMEM (alto glicosa) foi examinada por espectroscopia de absorción UV-visible en varios momentos.Como se mostra na figura complementaria 9, observáronse lixeiros cambios nas bandas de absorción de RuDA-NP en PBS a pH 7,4 / 9,0, FBS e DMEM, o que indica unha excelente estabilidade de RuDA-NP.Non obstante, nun medio ácido (рН = 5,4) atopouse a hidrólise do mineral.Tamén avaliamos aínda máis a estabilidade de RuDA e RuDA-NP mediante métodos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).Como se mostra na Figura 10 complementaria, RuDA foi estable nunha mestura de metanol e auga (50/50, v/v) durante a primeira hora e observouse a hidrólise despois de 4 horas.Non obstante, só se observou un amplo pico cóncavo-convexo para os NP RuDA.Polo tanto, utilizouse a cromatografía de permeación en xel (GPC) para avaliar a estabilidade dos RuDA NPs en PBS (pH = 7,4).Como se mostra na figura complementaria 11, despois de 8 horas de incubación nas condicións probadas, a altura do pico, o ancho e a área pico de NP RuDA non cambiaron significativamente, o que indica unha excelente estabilidade de NP RuDA.Ademais, as imaxes TEM mostraron que a morfoloxía das nanopartículas RuDA-NP permaneceu practicamente sen cambios despois de 24 horas no tampón PBS diluído (pH = 7,4, figura complementaria 12).
Debido a que a autoensamblaxe pode conferir diferentes características funcionais e químicas ao mineral, observamos a liberación de ácido 9,10-antracenodiilbis(metilen)dimalónico (ABDA, indicador 1O2) en mesturas de metanol e auga.Mena con distinto contido en auga50.Como se mostra na Figura 2D e na Figura 13 complementaria, non se observou degradación de ABDA cando o contido de auga estaba por debaixo do 20%.Cun aumento da humidade ata o 40%, produciuse a degradación de ABDA, como o demostra unha diminución da intensidade da fluorescencia de ABDA.Tamén se observou que un maior contido de auga produce unha degradación máis rápida, o que suxire que a autoensamblaxe de RuDA é necesaria e beneficiosa para a degradación de ABDA.Este fenómeno é moi diferente dos modernos cromóforos ACQ (agregación inducida por extinción).Cando se irradia cun láser cunha lonxitude de onda de 808 nm, o rendemento cuántico de 1O2 RuDA nunha mestura de 98% H2O/2% DMF é do 16,4%, o que é 82 veces maior que o do ICG (ΦΔ = 0,2%)51, demostrando unha notable eficiencia de xeración 1O2 RuDA no estado de agregación.
Spins de electróns usando 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) e N-óxido de 5,5-dimetil-1-pirrolina (DMPO) como trampas de spin. Utilizouse espectroscopia de resonancia (ESR) para identificar as especies resultantes. AFK.por RuDA.Como se mostra na figura complementaria 14, confirmouse que 1O2 se xera en tempos de irradiación entre 0 e 4 minutos.Ademais, cando se incubou RuDA con DMPO baixo irradiación, detectouse un típico sinal EPR de catro liñas de aducto DMPO-OH· 1:2:2:1, que indica a formación de radicais hidroxilo (OH·).En xeral, os resultados anteriores demostran a capacidade de RuDA para estimular a produción de ROS mediante un proceso de fotosensibilización dual tipo I/II.
Para comprender mellor as propiedades electrónicas de RuDA en formas monoméricas e agregadas, calculáronse os orbitais moleculares fronteirizos de RuDA en formas monoméricas e diméricas mediante o método DFT.Como se mostra na fig.Na figura 3A, o orbital molecular máis alto (HOMO) do RuDA monomérico está deslocalizado ao longo da columna vertebral do ligando e o orbital molecular máis baixo (LUMO) está centrado na unidade aceptora de TDP.Pola contra, a densidade electrónica no HOMO dímero concéntrase no ligando dunha molécula de RuDA, mentres que a densidade electrónica no LUMO concéntrase principalmente na unidade aceptora doutra molécula RuDA, o que indica que RuDA está no dímero.Características do CT.
A O HOMO e o LUMO do mineral calcúlanse en formas monoméricas e diméricas.B Niveis de enerxía singlete e triplete do mineral en monómeros e dímeros.C Niveis estimados de RuDA e posibles canles ISC como C monomérico e D dímero. As frechas indican posibles canles ISC.
Analizouse a distribución de electróns e buratos nos estados excitados de singlete de baixa enerxía de RuDA nas formas monomérica e dimérica mediante o software Multiwfn 3.852.53, que se calculou mediante o método TD-DFT.Como se indica na etiqueta adicional.Como se mostra nas Figuras 1-2, os buratos RDA monómeros deslocalízanse principalmente ao longo da columna vertebral do ligando nestes estados excitados de singlete, mentres que os electróns localízanse principalmente no grupo TDP, o que demostra as características intramoleculares da TC.Ademais, para estes estados excitados singlete, hai máis ou menos superposición entre os buratos e os electróns, o que suxire que estes estados excitados singlet fan algunha contribución da excitación local (LE).Para os dímeros, ademais das características intramoleculares de TC e LE, observouse unha certa proporción de características de TC intermoleculares nos respectivos estados, especialmente S3, S4, S7 e S8, baseadas na análise de TC intermolecular, coas transicións intermoleculares CT como as principais. (Táboa complementaria).3).
Para comprender mellor os resultados experimentais, exploramos aínda máis as propiedades dos estados excitados de RuDA para explorar as diferenzas entre monómeros e dímeros (táboas complementarias 4-5).Como se mostra na Figura 3B, os niveis de enerxía dos estados excitados singlete e triplete do dímero son moito máis densos que os do monómero, o que axuda a reducir a brecha de enerxía entre S1 e Tn. Informeuse de que as transicións ISC poderían realizarse dentro dunha pequena brecha de enerxía (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 e Tn54. Informeuse de que as transicións ISC poderían realizarse dentro dunha pequena brecha de enerxía (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 e Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергоды энерге1 энергеть энергетич 40, энергеть Сообщалось Informeuse de que as transicións ISC pódense realizar dentro dunha pequena brecha de enerxía (ΔES1-Tn <0,3 eV) entre S1 e Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергель шой энергете че10.Сич 1.10. Informeuse de que a transición ISC pódese realizar dentro dunha pequena brecha de enerxía (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 e Tn54.Ademais, só un orbital, ocupado ou desocupado, debe diferir nos estados de singlete e triplete ligados para proporcionar unha integral SOC distinta de cero.Así, baseándose na análise da enerxía de excitación e da transición orbital, todas as canles posibles da transición ISC móstranse nas Figs.3C,D.Notablemente, só está dispoñible unha canle ISC no monómero, mentres que a forma dimérica ten catro canles ISC que poden mellorar a transición ISC.Polo tanto, é razoable supoñer que cantas máis moléculas de RuDA estean agregadas, máis accesibles serán as canles ISC.Polo tanto, os agregados RuDA poden formar estruturas electrónicas de dúas bandas nos estados singlete e triplete, reducindo a brecha de enerxía entre S1 e Tn dispoñible, aumentando así a eficiencia do ISC para facilitar a xeración de 1O2.
Para dilucidar aínda máis o mecanismo subxacente, sintetizamos un composto de referencia do complexo areno-Ru (II) (RuET) substituíndo dous grupos etilo por dous grupos fenilo de trifenilamina en RuDA (Fig. 4A, para a caracterización completa, ver ESI, Suplementario 15). -21 ) Do doador (dietilamina) ao aceptor (TDF), RuET ten as mesmas características de TC intramolecular que RuDA.Como era de esperar, o espectro de absorción de RuET en DMF mostrou unha banda de transferencia de carga de baixa enerxía cunha forte absorción na rexión do infravermello próximo na rexión de 600-1100 nm (Fig. 4B).Ademais, a agregación de RuET tamén se observou cun aumento do contido de auga, o que se reflectiu no desprazamento ao vermello do máximo de absorción, que foi confirmado aínda máis mediante imaxes líquidas AFM (figura complementaria 22).Os resultados mostran que RuET, como RuDA, pode formar estados intramoleculares e autoensamblarse en estruturas agregadas.
Estrutura química do RuET.B Espectros de absorción de RuET en mesturas de varias proporcións de DMF e auga.Parcelas C EIS Nyquist para RuDA e RuET.Respostas fotocorrentes D de RuDA e RuET baixo a acción da radiación láser cunha lonxitude de onda de 808 nm.
A fotodegradación de ABDA en presenza de RuET foi avaliada por irradiación cun láser cunha lonxitude de onda de 808 nm.Sorprendentemente, non se observou ningunha degradación de ABDA en varias fraccións de auga (figura complementaria 23).Unha posible razón é que RuET non pode formar de forma eficiente unha estrutura electrónica en bandas porque a cadea de etilo non promove a transferencia de carga intermolecular eficiente.Polo tanto, realizáronse espectroscopias de impedancia electroquímica (EIS) e medicións de fotocorrente transitoria para comparar as propiedades fotoelectroquímicas de RuDA e RuET.Segundo o gráfico de Nyquist (Figura 4C), RuDA mostra un raio moito menor que RuET, o que significa que RuDA56 ten un transporte de electróns intermolecular máis rápido e unha mellor condutividade.Ademais, a densidade de fotocorrente de RuDA é moito maior que a de RuET (Fig. 4D), o que confirma a mellor eficiencia de transferencia de carga de RuDA57.Así, o grupo fenilo da trifenilamina no mineral xoga un papel importante na transferencia de carga intermolecular e na formación dunha estrutura electrónica en bandas.
Para aumentar a acumulación de tumores e a biocompatibilidade in vivo, encapsulamos aínda máis RuDA con F127.O diámetro hidrodinámico medio dos RuDA-NPs determinouse en 123,1 nm cunha distribución estreita (PDI = 0,089) mediante o método de dispersión dinámica da luz (DLS) (Figura 5A), que promoveu a acumulación de tumores aumentando a permeabilidade e a retención.efecto EPR).As imaxes TEM mostraron que os Ore NP teñen unha forma esférica uniforme cun diámetro medio de 86 nm.Notablemente, o máximo de absorción de RuDA-NP apareceu a 800 nm (figura complementaria 24), o que indica que os RuDA-NP poden conservar as funcións e propiedades dos RuDA autoensamblados.O rendemento cuántico de ROS calculado para NP Ore é do 15,9%, o que é comparable ao Ore. As propiedades fototérmicas dos RuDA NPs foron estudadas baixo a acción da radiación láser cunha lonxitude de onda de 808 nm utilizando unha cámara infravermella.Como se mostra na fig.5B,C, o grupo control (só PBS) experimentou un lixeiro aumento da temperatura, mentres que a temperatura da solución RuDA-NPs aumentou rapidamente co aumento da temperatura (ΔT) ata 15,5, 26,1 e 43,0 °C.As concentracións elevadas foron de 25, 50 e 100 µM, respectivamente, o que indica un forte efecto fototérmico dos RuDA NPs.Ademais, realizáronse medicións do ciclo de quecemento/arrefriamento para avaliar a estabilidade fototérmica de RuDA-NP e comparar co ICG.A temperatura dos Ore NPs non diminuíu despois de cinco ciclos de quecemento/arrefriamento (Fig. 5D), o que indica a excelente estabilidade fototérmica dos Ore NPs.Pola contra, o ICG presenta unha menor estabilidade fototérmica como se observa pola aparente desaparición da meseta de temperatura fototérmica nas mesmas condicións.Segundo o método anterior58, a eficiencia de conversión fototérmica (PCE) de RuDA-NP calculouse nun 24,2%, o que é superior aos materiais fototérmicos existentes, como os nanobarros de ouro (21,0%) e os nanoconchas de ouro (13,0%)59.Así, NP Ore presenta excelentes propiedades fototérmicas, o que os converte en axentes PTT prometedores.
Análise de imaxes DLS e TEM de RuDA NPs (inserto).B Imaxes térmicas de varias concentracións de RuDA NP expostos a radiación láser a unha lonxitude de onda de 808 nm (0,5 W cm-2).C Curvas de conversión fototérmica de varias concentracións de NP de mineral, que son datos cuantitativos.B. D Aumento da temperatura do ORE NP e ICG en 5 ciclos de quecemento-arrefriamento.
A fotocitotoxicidade de RuDA NPs contra células de cancro de mama humano MDA-MB-231 foi avaliada in vitro.Como se mostra na fig.6A, B, RuDA-NPs e RuDA mostraron unha citotoxicidade insignificante en ausencia de irradiación, o que implica unha menor toxicidade escura de RuDA-NP e RuDA.Non obstante, despois da exposición á radiación láser a unha lonxitude de onda de 808 nm, os NP RuDA e RuDA mostraron unha forte fotocitotoxicidade contra as células cancerosas MDA-MB-231 con valores de IC50 (concentración inhibitoria media máxima) de 5,4 e 9,4 μM, respectivamente, demostrando que RuDA-NP e RuDA teñen potencial para a fototerapia do cancro.Ademais, investigouse máis a fotocitotoxicidade de RuDA-NP e RuDA en presenza de vitamina C (Vc), un eliminador de ROS, para dilucidar o papel das ROS na citotoxicidade inducida pola luz.Obviamente, a viabilidade celular aumentou despois da adición de Vc, e os valores de IC50 de RuDA e RuDA NPs foron de 25,7 e 40,0 μM, respectivamente, o que demostra o importante papel de ROS na fotocitotoxicidade de RuDA e RuDA NPs.Citotoxicidade inducida pola luz de RuDA-NPs e RuDA en células cancerosas MDA-MB-231 por tinción de células vivas/mortas usando calceína AM (fluorescencia verde para células vivas) e ioduro de propidio (PI, fluorescencia vermella para células mortas).confirmado por células) como sondas fluorescentes.Como se mostra na Figura 6C, as células tratadas con RuDA-NP ou RuDA permaneceron viables sen irradiación, como demostra a intensa fluorescencia verde.Pola contra, baixo irradiación con láser só se observou fluorescencia vermella, o que confirma a fotocitotoxicidade efectiva dos NP RuDA ou RuDA.Cabe destacar que apareceu fluorescencia verde ao engadir Vc, o que indica unha violación da fotocitotoxicidade dos NP RuDA e RuDA.Estes resultados son consistentes cos ensaios de fotocitotoxicidade in vitro.
Viabilidade dependente da dose das células A RuDA- e B RuDA-NP en células MDA-MB-231 en presenza ou ausencia de Vc (0,5 mM), respectivamente.Barras de erro, media ± desviación estándar (n = 3). Probas t de dúas caras non apareadas *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Probas t de dúas caras non apareadas *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Probas t de dúas colas non emparelladas *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Probas t de dúas colas non emparelladas *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.C Análise de tinción de células vivas/mortas utilizando calceína AM e ioduro de propidio como sondas fluorescentes.Barra de escala: 30 µm.Móstranse imaxes representativas de tres repeticións biolóxicas de cada grupo.D Imaxes de fluorescencia confocal da produción de ROS en células MDA-MB-231 en diferentes condicións de tratamento.A fluorescencia de DCF verde indica a presenza de ROS.Irradiar cun láser cunha lonxitude de onda de 808 nm cunha potencia de 0,5 W/cm2 durante 10 minutos (300 J/cm2).Barra de escala: 30 µm.Móstranse imaxes representativas de tres repeticións biolóxicas de cada grupo.E Análise de tratamento con citometría de fluxo RuDA-NPs (50 µM) ou RuDA (50 µM) con ou sen láser de 808 nm (0,5 W cm-2) en presenza e ausencia de Vc (0,5 mM) durante 10 min.Móstranse imaxes representativas de tres repeticións biolóxicas de cada grupo.F Nrf-2, HSP70 e HO-1 de células MDA-MB-231 tratadas con RuDA-NPs (50 µM) con ou sen irradiación láser de 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), células expresan 2).Móstranse imaxes representativas de dúas repeticións biolóxicas de cada grupo.
A produción intracelular de ROS en células MDA-MB-231 examinouse mediante o método de tinción de diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA).Como se mostra na fig.6D, as células tratadas con RuDA-NPs ou RuDA mostraron unha fluorescencia verde distinta cando se irradiaron co láser de 808 nm, o que indica que RuDA-NPs e RuDA teñen unha capacidade eficiente para xerar ROS.Pola contra, en ausencia de luz ou en presenza de Vc, só se observou un débil sinal fluorescente das células, o que indicaba unha lixeira formación de ROS.Os niveis de ROS intracelulares nas células RuDA-NP e nas células MDA-MB-231 tratadas con RuDA determináronse ademais mediante citometría de fluxo.Como se mostra na figura complementaria 25, a intensidade media de fluorescencia (MFI) xerada por RuDA-NP e RuDA baixo a irradiación con láser de 808 nm aumentou significativamente unhas 5,1 e 4,8 veces, respectivamente, en comparación co grupo control, confirmando a súa excelente formación AFK.capacidade.Non obstante, os niveis intracelulares de ROS en células RuDA-NP ou MDA-MB-231 tratadas con RuDA só foron comparables aos controis sen irradiación con láser ou en presenza de Vc, semellante aos resultados da análise de fluorescencia confocal.
Demostrouse que as mitocondrias son o obxectivo principal dos complexos Ru(II)-areno60.Polo tanto, investigouse a localización subcelular de RuDA e RuDA-NPs.Como se mostra na Figura 26 complementaria, RuDA e RuDA-NP mostran perfís de distribución celular similares coa maior acumulación nas mitocondrias (62,5 ± 4,3 e 60,4 ± 3,6 ng/mg de proteína, respectivamente).Non obstante, só se atopou unha pequena cantidade de Ru nas fraccións nucleares de Ore e NP Ore (3,5 e 2,1 %, respectivamente).A fracción celular restante contiña rutenio residual: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg de proteína) para RuDA e 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg de proteína) para RuDA-NPs.En xeral, o mineral e o mineral NP acumúlanse principalmente nas mitocondrias.Para avaliar a disfunción mitocondrial, utilizamos a tinción JC-1 e MitoSOX Red para avaliar o potencial da membrana mitocondrial e a capacidade de produción de superóxido, respectivamente.Como se mostra na figura complementaria 27, observouse fluorescencia verde intenso (JC-1) e vermello (Vermello MitoSOX) nas células tratadas con RuDA e RuDA-NP baixo irradiación con láser de 808 nm, o que indica que tanto RuDA como RuDA-NP son altamente fluorescentes. Pode inducir eficazmente a despolarización da membrana mitocondrial e a produción de superóxido.Ademais, o mecanismo da morte celular determinouse mediante a análise baseada na citometría de fluxo da anexina V-FITC/ioduro de propidio (PI).Como se mostra na Figura 6E, cando se irradiaron con láser de 808 nm, RuDA e RuDA-NP inducían un aumento significativo da taxa de apoptose precoz (cuadrante inferior dereito) nas células MDA-MB-231 en comparación con PBS ou PBS máis láser.células procesadas.Non obstante, cando se engadiu Vc, a taxa de apoptose de RuDA e RuDA-NP diminuíu significativamente de 50,9% e 52,0% a 15,8% e 17,8%, respectivamente, o que confirma o importante papel de ROS na fotocitotoxicidade de RuDA e RuDA-NP..Ademais, observáronse células necróticas leves en todos os grupos probados (cuadrante superior esquerdo), o que suxire que a apoptose pode ser a forma predominante de morte celular inducida por RuDA e RuDA-NP.
Dado que o dano por estrés oxidativo é un determinante importante da apoptose, o factor nuclear asociado ao eritroide 2, factor 2 (Nrf2) 62, un regulador clave do sistema antioxidante, investigouse no MDA-MB-231 tratado con RuDA-NPs.Mecanismo de acción das NP RuDA inducidas pola irradiación.Ao mesmo tempo, tamén se detectou a expresión da proteína hemo osixenase 1 (HO-1) abaixo.Como se mostra na Figura 6F e na Figura 29 complementaria, a fototerapia mediada por RuDA-NP aumentou os niveis de expresión de Nrf2 e HO-1 en comparación co grupo PBS, o que indica que os RuDA-NP poden estimular as vías de sinalización do estrés oxidativo.Ademais, para estudar o efecto fototérmico de RuDA-NPs63, tamén se avaliou a expresión da proteína de choque térmico Hsp70.Está claro que as células tratadas con RuDA-NPs + irradiación con láser de 808 nm mostraron unha maior expresión de Hsp70 en comparación cos outros dous grupos, o que reflicte unha resposta celular á hipertermia.
Os notables resultados in vitro impulsáronnos a investigar o rendemento in vivo de RuDA-NP en ratos espidos con tumores MDA-MB-231.A distribución tisular dos RuDA NPs estudouse determinando o contido de rutenio no fígado, corazón, bazo, riles, pulmóns e tumores.Como se mostra na fig.Na figura 7A, o contido máximo de NPs de mineral nos órganos normais apareceu no primeiro momento de observación (4 h), mentres que o contido máximo determinouse nos tecidos tumorais 8 horas despois da inxección, posiblemente debido a NPs de mineral.Efecto EPR de LF.Segundo os resultados da distribución, a duración óptima do tratamento con mineral NP tomouse 8 horas despois da administración.Para ilustrar o proceso de acumulación de RuDA-NP en sitios tumorais, monitorizáronse as propiedades fotoacústicas (PA) dos RuDA-NP rexistrando os sinais de PA de RuDA-NP en diferentes momentos despois da inxección.En primeiro lugar, o sinal de PA de RuDA-NP in vivo foi avaliado gravando imaxes de PA dun sitio tumoral despois da inxección intratumoral de RuDA-NP.Como se mostra na Figura 30 complementaria, os RuDA-NP mostraron un forte sinal de PA e houbo unha correlación positiva entre a concentración de RuDA-NP e a intensidade do sinal de PA (Figura 30A complementaria).Despois, graváronse imaxes de PA in vivo dos sitios tumorais despois da inxección intravenosa de RuDA e RuDA-NP en diferentes momentos despois da inxección.Como se mostra na Figura 7B, o sinal de PA dos RuDA-NP do sitio do tumor aumentou gradualmente co tempo e alcanzou unha meseta 8 horas despois da inxección, de acordo cos resultados da distribución do tecido determinados pola análise ICP-MS.Con respecto a RuDA (figura complementaria 30B), a intensidade máxima do sinal de PA apareceu 4 horas despois da inxección, o que indica unha taxa rápida de entrada de RuDA no tumor.Ademais, investigouse o comportamento excretor de RuDA e RuDA-NP determinando a cantidade de rutenio na urina e as feces mediante ICP-MS.A principal vía de eliminación de RuDA (Fig. 31 complementaria) e RuDA-NP (Fig. 7C) é a través das feces, e observouse a eliminación efectiva de RuDA e RuDA-NP durante o período de estudo de 8 días, o que significa que RuDA e RuDA-NPs poden ser eliminados do corpo de forma eficiente sen toxicidade a longo prazo.
A. A distribución ex vivo de RuDA-NP nos tecidos de rato determinouse polo contido de Ru (porcentaxe da dose administrada de Ru (ID) por gramo de tecido) en diferentes momentos despois da inxección.Os datos son media ± desviación estándar (n = 3). Probas t de dúas caras non apareadas *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Probas t de dúas caras non apareadas *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Probas t de dúas colas non emparelladas *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Probas t de dúas colas non emparelladas *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.Imaxes de B PA de sitios tumorais in vivo a 808 nm de excitación despois da administración intravenosa de RuDA-NPs (10 µmol kg-1) en diferentes momentos.Despois da administración intravenosa de RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru foi excretado dos ratos con ouriños e feces a diferentes intervalos de tempo.Os datos son media ± desviación estándar (n = 3).
A capacidade de quecemento de RuDA-NP in vivo estudouse en ratos espidos con tumores MDA-MB-231 e RuDA para a súa comparación.Como se mostra na fig.8A e figura complementaria 32, o grupo control (solución salina) mostrou menos cambio de temperatura (ΔT ≈ 3 °C) despois de 10 minutos de exposición continua.Non obstante, a temperatura de RuDA-NPs e RuDA aumentou rapidamente con temperaturas máximas de 55,2 e 49,9 °C, respectivamente, proporcionando hipertermia suficiente para a terapia contra o cancro in vivo.O aumento observado na alta temperatura dos NP RuDA (ΔT ≈ 24 °C) en comparación co RuDA (ΔT ≈ 19 °C) pode deberse á súa mellor permeabilidade e acumulación nos tecidos tumorais debido ao efecto EPR.
Imaxes térmicas por infravermellos de ratos con tumores MDA-MB-231 irradiados con láser de 808 nm en diferentes momentos 8 horas despois da inxección.Móstranse imaxes representativas de catro repeticións biolóxicas de cada grupo.B Volume relativo do tumor e C Masa tumoral media de diferentes grupos de ratos durante o tratamento.D Curvas de pesos corporais de distintos grupos de ratos.Irradiar cun láser cunha lonxitude de onda de 808 nm cunha potencia de 0,5 W/cm2 durante 10 minutos (300 J/cm2).Barras de erro, media ± desviación estándar (n = 3). Probas t de dúas caras non apareadas *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Probas t de dúas caras non apareadas *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Probas t de dúas colas non emparelladas *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001. Probas t de dúas colas non emparelladas *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Imaxes de tinción de E H&E dos principais órganos e tumores de diferentes grupos de tratamento, incluídos os grupos Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser. Imaxes de tinción de E H&E dos principais órganos e tumores de diferentes grupos de tratamento, incluídos os grupos Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Imaxes de tinción E H&E dos principais órganos e tumores de diferentes grupos de tratamento, incluíndo os grupos de solución salina, solución salina + láser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + Láser.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 态盐水+ 来自不倿 Ru DA〉怿 Ru DA〉 恀DA来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Tinción E H&E dos principais órganos e tumores de varios grupos de tratamento, incluíndo solución salina, solución salina + láser, RuDA, RuDA + láser, RuDA-NPs e RuDA-NPs + láser.Barra de escala: 60 µm.
Avaliouse o efecto da fototerapia in vivo con RuDA e RuDA NPs na que ratos espidos con tumores MDA-MB-231 foron inxectados por vía intravenosa con RuDA ou RuDA NP nunha única dose de 10,0 µmol kg-1 a través da vea da cola, e despois 8. horas despois da inxección.irradiación láser cunha lonxitude de onda de 808 nm.Como se mostra na Figura 8B, os volumes do tumor aumentaron significativamente nos grupos con solución salina e con láser, o que indica que a irradiación con solución salina ou con láser 808 tivo pouco efecto no crecemento do tumor.Como no grupo de solución salina, tamén se observou un rápido crecemento do tumor en ratos tratados con RuDA-NP ou RuDA en ausencia de irradiación con láser, demostrando a súa baixa toxicidade escura.En cambio, despois da irradiación con láser, tanto o tratamento con RuDA-NP como o RuDA inducían unha regresión tumoral significativa con reducións do volume do tumor do 95,2% e do 84,3%, respectivamente, en comparación co grupo tratado con solución salina, o que indica unha excelente PDT sinérxica., mediado polo efecto RuDA/CHTV.– NP ou Ore. En comparación con RuDA, os RuDA NP mostraron un mellor efecto fototerapéutico, que se debe principalmente ao efecto EPR dos RuDA NP.Os resultados da inhibición do crecemento do tumor foron avaliados aínda máis polo peso do tumor extirpado o día 15 do tratamento (Fig. 8C e Fig. 33 complementario).A masa tumoral media en ratos tratados con RuDA-NP e ratos tratados con RuDA foi de 0,08 e 0,27 g, respectivamente, o que foi moito máis lixeiro que no grupo control (1,43 g).
Ademais, o peso corporal dos ratos rexistrouse cada tres días para estudar a toxicidade escura de RuDA-NPs ou RuDA in vivo.Como se mostra na Figura 8D, non se observaron diferenzas significativas no peso corporal para todos os grupos de tratamento. Ademais, realizouse a tinción con hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órganos (corazón, fígado, bazo, pulmón e ril) de diferentes grupos de tratamento. Ademais, realizouse a tinción con hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órganos (corazón, fígado, bazo, pulmón e ril) de diferentes grupos de tratamento. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Ademais, realizouse a tinción con hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órganos (corazón, fígado, bazo, pulmóns e riles) de diferentes grupos de tratamento.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行芏）进行柉进行苲官 (H&E) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Ademais, realizouse a tinción con hematoxilina e eosina (H&E) dos principais órganos (corazón, fígado, bazo, pulmón e ril) en diferentes grupos de tratamento.Como se mostra na Fig.8E, as imaxes de tinción H&E de cinco órganos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA non presentan anomalías obvias nin danos nos órganos. 8E, as imaxes de tinción H&E de cinco órganos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA non presentan anomalías obvias nin danos nos órganos.Como se mostra na fig.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs e RuDA не демонстрируюти основных органов из групп. 8E, as imaxes de tinción H&E de cinco órganos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA non mostran anomalías ou lesións orgánicas obvias.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示傘显示出显示傘显示出显示出渻要器官的如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E К показано н р иу 8e, зобобения окрашивания h & e птти основOR Como se mostra na Figura 8E, as imaxes de tinción de H&E dos cinco órganos principais dos grupos RuDA-NPs e RuDA non mostraron anomalías obvias nin danos nos órganos.Estes resultados mostraron que nin RuDA-NP nin RuDA mostraron signos de toxicidade in vivo. Ademais, as imaxes de tinción de H&E dos tumores mostraron que tanto os grupos RuDA + Laser como RuDA-NPs + Laser poderían causar unha destrución severa das células cancerosas, demostrando a excelente eficacia fototerapéutica in vivo de RuDA e RuDA-NPs. Ademais, as imaxes de tinción de H&E dos tumores mostraron que tanto os grupos RuDA + Laser como RuDA-NPs + Laser poderían causar unha destrución severa das células cancerosas, demostrando a excelente eficacia fototerapéutica in vivo de RuDA e RuDA-NPs.Ademais, as imaxes de tumores tinguidas con hematoxilina e eosina mostraron que tanto os grupos RuDA+Laser como RuDA-NPs+Laser poden inducir a destrución severa das células cancerosas, demostrando a eficacia fototerapéutica superior de RuDA e RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示 ， ruda + láser 和 ruda-nps + láser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 ， ， 证明 了 了 了 了 了 了 证明 证明 证明 证明 证明 证明 ， ， ， 光疗 光疗 功效 功效 功效 功效此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + láser 和 ruda-nps + láser 组均 导致 的 癌 细胞 ， ， 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗 光疗。。。Ademais, as imaxes de tumores tinguidas con hematoxilina e eosina mostraron que tanto os grupos RuDA+Laser como RuDA-NPs+Laser provocaron unha grave destrución das células cancerosas, demostrando unha eficacia fototerapéutica superior de RuDA e RuDA-NPs in vivo.
En conclusión, o complexo organometálico Ru(II)-areno (RuDA) con ligandos tipo DA foi deseñado para facilitar o proceso ISC mediante o método de agregación.RuDA sintetizado pode autoensamblarse mediante interaccións non covalentes para formar sistemas supramoleculares derivados de RuDA, facilitando así a formación de 1O2 e unha conversión fototérmica eficiente para a terapia contra o cancro inducida pola luz.Cabe destacar que o RuDA monomérico non xerou 1O2 baixo irradiación con láser a 808 nm, senón que podería xerar unha gran cantidade de 1O2 en estado agregado, demostrando a racionalidade e eficiencia do noso deseño.Estudos posteriores demostraron que a ensamblaxe supramolecular dota a RuDA de propiedades fotofísicas e fotoquímicas melloradas, como a absorción ao redshift e a resistencia ao fotobranqueamento, que son moi desexables para o procesamento de PDT e PTT.Tanto os experimentos in vitro como in vivo demostraron que as NP RuDA cunha boa biocompatibilidade e boa acumulación no tumor presentan unha excelente actividade anticanceríxena inducida pola luz tras irradiación con láser a unha lonxitude de onda de 808 nm.Así, os RuDA NPs como reactivos supramoleculares bimodais eficaces PDT/PTW enriquecerán o conxunto de fotosensibilizadores activados a lonxitudes de onda superiores a 800 nm.O deseño conceptual do sistema supramolecular proporciona unha ruta eficiente para os fotosensibilizadores activados por NIR con excelentes efectos fotosensibilizadores.
Todos os produtos químicos e disolventes obtivéronse de provedores comerciais e utilizáronse sen máis purificación.O RuCl3 foi adquirido de Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, China).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona) e 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 O ,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol foi sintetizado segundo estudos anteriores64,65.Os espectros de RMN rexistráronse nun espectrómetro Bruker Avance III-HD 600 MHz no Southeastern University Analytical Test Center usando d6-DMSO ou CDCl3 como disolvente.Os desprazamentos químicos δ danse en ppm.con respecto ao tetrametilsilano, e as constantes de interacción J danse en valores absolutos en hercios.Realizouse a espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) nun instrumento Agilent 6224 ESI/TOF MS.A análise elemental de C, H e N realizouse nun analizador elemental Vario MICROCHNOS (Elementar).Os espectros UV-visibles foron medidos nun espectrofotómetro Shimadzu UV3600.Os espectros de fluorescencia rexistráronse nun espectrofluorímetro Shimadzu RF-6000.Os espectros EPR foron rexistrados nun instrumento Bruker EMXmicro-6/1.A morfoloxía e a estrutura das mostras preparadas foron estudadas en instrumentos FEI Tecnai G20 (TEM) e Bruker Icon (AFM) que funcionan a unha tensión de 200 kV.A dispersión dinámica da luz (DLS) realizouse nun analizador Nanobrook Omni (Brookhaven).As propiedades fotoelectroquímicas foron medidas nunha configuración electroquímica (CHI-660, China).As imaxes fotoacústicas obtivéronse mediante o sistema FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.As imaxes confocais obtivéronse mediante un microscopio confocal Olympus FV3000.A análise FACS realizouse nun citómetro de fluxo BD Calibur.Realizáronse experimentos de cromatografía líquida de alto rendemento (HPLC) nun sistema Waters Alliance e2695 utilizando un detector UV/Vis 2489.As probas de cromatografía de permeación en xel (GPC) rexistráronse nun instrumento Thermo ULTIMATE 3000 utilizando un detector de índice de refracción ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) e ácido acético glacial (30 ml) foron axitados na neveira de refluxo durante 12 horas.Despois, o disolvente eliminouse ao baleiro mediante un evaporador rotatorio.O residuo resultante purificouse mediante cromatografía en columna ultrarrápida (xel de sílice, CH2Cl2:MeOH=20:1) para obter RuDA como un po verde (rendemento: 877,5 mg, 80%).ano.Calculado para C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Atopado: C 67,92, H 4,26, N 9,82.RMN 1H (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c RMN (150 MHz, D6-DMSO), δ (ppm) 158,03, 152,81, 149,31, 147,98, 147,16, 139,98, 136,21, 135,57, 134,68, 130,51, 130,02, 128,4, 1201, 1201,01, 124,45.12.01. , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Síntese de 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2): L2 sintetizouse en dous pasos.Engadiuse Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) á solución de N,N-dietil-4-(tributilstanil)anilina (1,05 g, 2,4 mmol) e 4,7-dibromo-5,6-dinitro - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) en tolueno seco (100 ml).A mestura foi axitada a 100 °C durante 24 horas.Despois de eliminar o tolueno ao baleiro, o sólido resultante lavouse con éter de petróleo.Despois, unha mestura deste composto (234,0 mg, 0,45 mmol) e po de ferro (0,30 g, 5,4 mmol) en ácido acético (20 ml) foi axitada a 80 °C durante 4 horas.A mestura de reacción foi vertida en auga e o sólido marrón resultante foi recollido por filtración.O produto purificouse dúas veces por sublimación ao baleiro para dar un sólido verde (126,2 mg, 57 % de rendemento).ano.Calculado para C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Atopado: C 67,84, H 6,95, H 18,16.RMN 1H (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13С RMN (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Os compostos preparáronse e purificáronse seguindo procedementos similares ao RuDA.ano.Calculado para C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Atopado: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, RMN 1H (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C RMN (151 MHz, CDCL3), δ (ppm) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76.76.07.07.07.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA foi disolto en MeOH/H2O (5/95, v/v) a unha concentración de 10 μM.O espectro de absorción de RuDA foi medido cada 5 minutos nun espectrofotómetro Shimadzu UV-3600 baixo irradiación con luz láser cunha lonxitude de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).Os espectros ICG foron rexistrados nas mesmas condicións que o estándar.
Os espectros EPR rexistráronse nun espectrómetro Bruker EMXmicro-6/1 cunha potencia de microondas de 20 mW, un rango de exploración de 100 G e unha modulación de campo de 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidona (TEMP) e N-óxido de 5,5-dimetil-1-pirrolina (DMPO) utilizáronse como trampas de spin.Os espectros de resonancia de espín electrónico rexistráronse para solucións mixtas de RuDA (50 µM) e TEMF (20 mM) ou DMPO (20 mM) baixo a acción da radiación láser cunha lonxitude de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).
Os cálculos de DFT e TD-DFT para RuDA realizáronse a niveis de PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ en solución acuosa utilizando o programa gaussiano 1666,67,68.As distribucións HOMO-LUMO, buratos e electróns do estado excitado de singlete de baixa enerxía RuDA foron representadas mediante o programa GaussView (versión 5.0).
Primeiro tentamos medir a eficiencia de xeración de 1O2 RuDA mediante espectroscopia UV-visible convencional con ICG (ΦΔ = 0,002) como estándar, pero a fotodegradación do ICG afectou moito aos resultados.Así, o rendemento cuántico de 1O2 RuDA foi medido detectando un cambio na intensidade da fluorescencia ABDA a uns 428 nm cando se irradiou cun láser cunha lonxitude de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).Realizáronse experimentos con RuDA e RuDA NPs (20 μM) en auga/DMF (98/2, v/v) que contén ABDA (50 μM).O rendemento cuántico de 1O2 calculouse mediante a seguinte fórmula: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS e rICG son as velocidades de reacción de ABDA con 1O2 obtidas do fotosensibilizador e ICG, respectivamente.APS e AICG son a absorbancia do fotosensibilizador e ICG a 808 nm, respectivamente.
As medicións AFM realizáronse en condicións líquidas usando o modo de exploración nun sistema AFM Bruker Dimension Icon.Usando unha estrutura aberta con células líquidas, as células laváronse dúas veces con etanol e secáronse cunha corrente de nitróxeno.Insira as células secas na cabeza óptica do microscopio.Coloque inmediatamente unha gota da mostra na piscina de líquido e colócaa no voladizo usando unha xeringa de plástico desbotable estéril e unha agulla estéril.Outra gota colócase directamente sobre a mostra, e cando se baixa a cabeza óptica, as dúas gotas únense, formando un menisco entre a mostra e o depósito de líquido.As medicións de AFM realizáronse mediante un voladizo de nitruro en forma de V SCANASYST-FLUID (Bruker, dureza k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
Os cromatogramas de HPLC obtivéronse nun sistema Waters e2695 equipado cunha columna Phoenix C18 (250×4,6 mm, 5 µm) utilizando un detector 2489 UV/Vis.A lonxitude de onda do detector é de 650 nm.As fases móbiles A e B foron auga e metanol, respectivamente, e o caudal da fase móbil foi de 1,0 ml·min-1.O gradiente (disolvente B) foi o seguinte: 100% de 0 a 4 minutos, 100% a 50% de 5 a 30 minutos e reinicio ao 100% de 31 a 40 minutos.O mineral foi disolto nunha solución mixta de metanol e auga (50/50, en volume) a unha concentración de 50 μM.O volume de inxección foi de 20 μl.
Os ensaios GPC rexistráronse nun instrumento Thermo ULTIMATE 3000 equipado con dúas columnas PL aquagel-OH MIXED-H (2 × 300 × 7,5 mm, 8 µm) e un detector de índice de refracción ERC RefratoMax520.A columna GPC eluíuse con auga a un caudal de 1 ml/min a 30 °C.Os NP de mineral disolvéronse en solución de PBS (pH = 7,4, 50 μM), o volume de inxección foi de 20 μL.
As fotocorrentes midéronse nunha instalación electroquímica (CHI-660B, China).As respostas optoelectrónicas cando se acendeu e apagaba o láser (808 nm, 0,5 W/cm2) midéronse a unha tensión de 0,5 V nunha caixa negra, respectivamente.Utilizouse unha pila estándar de tres electrodos cun electrodo de carbono vítreo (GCE) en forma de L como electrodo de traballo, un electrodo de calomel estándar (SCE) como electrodo de referencia e un disco de platino como contraelectrodo.Utilizouse unha solución 0,1 M de Na2SO4 como electrólito.
A liña celular de cancro de mama humano MDA-MB-231 foi adquirida de KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, China, número de catálogo: KG033).As células cultiváronse en monocapas no medio de aguia modificado de Dulbecco (DMEM, alto nivel de glicosa) complementado cunha solución de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 μg/ml) e estreptomicina (100 μg/ml).Todas as células foron cultivadas a 37 °C nunha atmosfera húmida con 5% de CO2.
O ensaio MTT utilizouse para determinar a citotoxicidade de RuDA e RuDA-NP en presenza e ausencia de irradiación luminosa, con ou sen Vc (0,5 mM).As células cancerosas MDA-MB-231 cultiváronse en placas de 96 pocillos cunha densidade celular de aproximadamente 1 x 105 células/ml/pozo e incubáronse durante 12 horas a 37,0 °C nunha atmosfera de 5 % de CO2 e 95 % de aire.Engadíronse ás células RuDA e RuDA NP disoltos en auga.Despois de 12 horas de incubación, as células foron expostas a unha radiación láser de 0,5 W cm -2 a unha lonxitude de onda de 808 nm durante 10 minutos (300 J cm -2) e despois incubáronse na escuridade durante 24 horas.Despois incubáronse as células con MTT (5 mg/ml) durante outras 5 horas.Finalmente, cambie o medio a DMSO (200 µl) para disolver os cristais de formazán roxo resultantes.Os valores de DO foron medidos usando un lector de microplacas cunha lonxitude de onda de 570/630 nm.O valor IC50 para cada mostra calculouse mediante o software SPSS a partir de curvas dose-resposta obtidas de polo menos tres experimentos independentes.
As células MDA-MB-231 foron tratadas con RuDA e RuDA-NP a unha concentración de 50 μM.Despois de 12 horas de incubación, irradiáronse as células cun láser cunha lonxitude de onda de 808 nm e unha potencia de 0,5 W/cm2 durante 10 min (300 J/cm2).No grupo de vitamina C (Vc), as células foron tratadas con 0,5 mM de Vc antes da irradiación con láser.A continuación, incubáronse as células na escuridade durante 24 horas adicionais, despois tinguironse con calceína AM e ioduro de propidio (20 μg/ml, 5 μl) durante 30 minutos e despois laváronse con PBS (10 μl, pH 7,4).imaxes de células tinguidas.