Grazas por visitar Nature.com.A versión do navegador que estás a usar ten soporte CSS limitado.Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que utilices un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer).Mentres tanto, para garantir a asistencia continua, renderizaremos o sitio sen estilos e JavaScript.
Os métodos de marcado enzimático de proximidade baseados en ésteres activados ou radicais fenoxi utilízanse amplamente para mapear proteomas subcelulares e interactores de proteínas en células vivas.Non obstante, os ésteres activados son menos reactivos, o que dá como resultado un amplo radio de marcado, e os radicais fenoxi xerados polo tratamento con peróxido poden interferir coas vías redox.Aquí informamos dun método de fotoactivación dependente da etiquetaxe de proximidade (PDPL) desenvolvido pola unión xenética da proteína fotosensibilizadora miniSOG cunha proteína de interese.Activado pola luz azul e controlado polo tempo de exposición, xérase o osíxeno singlete e despois conséguese o marcado espazo-temporal dos residuos de histidina mediante a sonda de anilina.Demostramos a súa alta fidelidade a través do mapeo de proteomas específicos de orgánulos.Unha comparación lado a lado de PDPL con TurboID mostra unha cobertura proteómica máis específica e completa de PDPL.A continuación, aplicamos PDPL ao coactivador transcricional asociado á enfermidade BRD4 e E3 Parkin ligase e atopamos interactores descoñecidos.Mediante o cribado de sobreexpresión, identificáronse dous substratos descoñecidos, Ssu72 e SNW1, para a Parkina, cuxa degradación está mediada pola vía de ubiquitinación-proteasoma.
A caracterización precisa das redes de proteínas subxace en moitos procesos celulares fundamentais.Polo tanto, a cartografía espazo-temporal altamente precisa das interaccións de proteínas proporcionará unha base molecular para descifrar as vías biolóxicas, a patoloxía da enfermidade e interromper estas interaccións con fins terapéuticos.Para iso, son moi desexables métodos capaces de detectar interaccións temporais en células ou tecidos vivos.A espectrometría de masas de purificación por afinidade (AP-MS) utilizouse historicamente para identificar socios de unión de proteínas de interese (POI).Co desenvolvemento de métodos de proteómica cuantitativa, creouse Bioplex3.0, a maior base de datos de redes de proteínas baseada en AP-MS.Aínda que a AP-MS é moi poderosa, os pasos de lise celular e de dilución no fluxo de traballo están sesgados cara a interaccións de unión débiles e transitorias e introducen artefactos post-lise como pares de interacción espurias que carecen de compartimentación antes da lise.
Para resolver estes problemas, desenvolvéronse aminoácidos non naturais (UAA) con grupos de reticulación e plataformas de etiquetaxe enzimática (PL) (por exemplo, APEX e BioID)5.Aínda que o método UAA aplicouse con éxito en moitos escenarios e proporciona información sobre adhesivos proteicos directos, aínda é necesaria a optimización do sitio de inserción da UAA.Máis importante aínda, é un método de etiquetado estequiométrico que carece dunha reversión catalítica dos eventos de etiquetaxe.Pola contra, os métodos enzimáticos de PL, como o método BioID, fusionan a biotina ligase manipulada con POI7, que posteriormente activa a biotina para formar un intermedio reactivo de éster de biotinilo-AMP.Así, o encima cataliza e libera unha "nube" de biotina activada que marca os residuos de lisina proximais.Non obstante, BioID require máis de 12 horas para obter un sinal marcado suficiente, o que impide o seu uso con resolución temporal.Usando a evolución dirixida baseada na visualización de lévedos, TurboID foi deseñado baseándose en BioID para ser máis eficiente, permitindo unha etiquetaxe eficiente con biotina en 10 minutos, permitindo estudar procesos máis dinámicos.Debido a que TurboID é moi activo e os niveis de biotina endóxena son suficientes para o etiquetado de baixo nivel, a etiquetaxe de fondo convértese nun problema potencial cando se require unha etiquetaxe moi mellorada e cronometrada pola adición de biotina esóxena.Ademais, os ésteres activados son pouco reactivos (t1/2 ~ 5 min), o que pode levar a un gran radio de marcado, especialmente despois da saturación das proteínas veciñas con biotina 5. Noutro enfoque, a fusión xenética de ascorbato peroxidase (é dicir, biotina- radicais fenólicos e permite o marcado de proteínas nun minuto9, 10. APEX utilízase amplamente para identificar proteomas subcelulares, complexos de proteínas de membrana e complexos de proteínas de sinalización citosólica 11, 12. Non obstante, a necesidade de altas concentracións de peróxidos pode afectar ás proteínas ou vías redox, interrompendo procesos celulares.
Así, un novo método capaz de xerar especies de supresión de radio marcado máis reactivas cunha alta precisión espacial e temporal sen perturbar significativamente as vías celulares será unha importante adición aos métodos existentes. Entre as especies reactivas, o osíxeno singlete espertou a nosa atención pola súa curta vida útil e o seu radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs nas células)13. Entre as especies reactivas, o osíxeno singlete espertou a nosa atención pola súa curta vida útil e o seu radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs nas células)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Entre as formas activas, o osíxeno singlete chamou a nosa atención debido á súa curta vida útil e ao seu radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs nas células)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0,6 µs 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Entre as formas activas, o osíxeno singlete chama a nosa atención pola súa curta vida útil e o seu radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 μs nas células).Informese que o osíxeno singlete oxida aleatoriamente metionina, tirosina, histidina e triptófano, polo que o fai polar 14,15 para a unión a sondas baseadas en aminas ou tioles16,17.Aínda que se utilizou o osíxeno singlete para marcar o ARN do compartimento subcelular, as estratexias para reutilizar os marcadores de proximidade de POI endóxenos seguen sen explorar.Aquí, presentamos unha plataforma chamada etiquetaxe de proximidade dependente da fotoactivación (PDPL), onde usamos luz azul para iluminar os puntos de interés fusionados cun fotosensibilizador miniSOG e activamos a xeración de osíxeno singlete para oxidar os residuos proximais, seguido de modificacións que conteñen aminas para oxidar sondas químicas en células vivas intermedias..Probamos un grupo de sondas químicas para maximizar a especificidade das etiquetas e identificamos sitios de modificación mediante un fluxo de traballo de proteómica aberto.Unha comparación lado a lado de PDPL con TurboID mostra unha cobertura proteómica máis específica e completa de PDPL.Aplicamos este enfoque aos marcadores específicos de orgánulos do proteoma subcelular e á identificación xeral do proteoma dos socios de unión para a proteína reguladora epixenética asociada ao cancro BRD4 e a E3 ligase Parkin asociada á enfermidade de Parkinson, o que confirmou unha rede coñecida e unha descoñecida de proteínas. interaccións..A capacidade do PDPL para recoñecer substratos de E3 en grandes complexos de proteínas representa unha situación na que se require o recoñecemento de aglutinantes indirectos.Confirmáronse in situ dous substratos de parkin descoñecidos mediados por ubiquitinación-proteasoma.
A terapia fotodinámica (PDT)19 e a inactivación con láser asistida por cromóforos (CALI)20, na que a irradiación luminosa con fotosensibilizadores xera osíxeno singlete, poden inactivar proteínas diana ou provocar a morte celular.Dado que o osíxeno singlete é unha substancia altamente reactiva cunha distancia de difusión teórica duns 70 nm, pódese controlar a oxidación espacialmente limitada ao redor do fotosensibilizador.En base a este concepto, decidimos utilizar o osíxeno singlete para conseguir un marcado próximo dos complexos proteicos nas células vivas.Desenvolvemos un enfoque quimioproteómico PDPL para cumprir catro funcións: (1) catalizar a xeración de osíxeno singlete activo similar ao enfoque enzimático PL;(2) proporcionar unha etiquetaxe resolta no tempo ao iniciarse a luz;(3) por alteración (4) Evite o uso de cofactores endóxenos (como a biotina) para reducir o fondo ou use reactivos exóxenos altamente perturbadores (como peróxidos) para minimizar a exposición das células ao estrés ambiental.
Os fotosensibilizadores pódense dividir en dúas categorías, incluíndo fluoróforos de pequeno peso molecular (por exemplo, rosa de bengala, azul de metileno)22 e pequenas proteínas codificadas xeneticamente (por exemplo, miniSOG, KillerRed)23.Para conseguir un deseño modular, desenvolvemos a plataforma PDPL de primeira xeración engadindo proteínas fotosensibilizadoras (PS) a POI24,25 (Figura 1a).Cando se irradia con luz azul, o osíxeno singlete oxida os residuos de aminoácidos nucleófilos proximais, o que dá lugar a unha polaridade umpolung que é electrófila e pode reaccionar aínda máis cos nucleófilos da sonda de amina16,17.A sonda está deseñada cun mango alquino para permitir a química de clic e tirar cara abaixo para a caracterización LC/MS/MS.
Ilustración esquemática do marcado de complexos proteicos mediados por miniSOG.Cando se exponen á luz azul, as células que expresan miniSOG-POI xeran osíxeno singlete, que modifica as proteínas que interactúan pero non as proteínas que non se unen.Os produtos intermedios da fotooxidación son interceptados por etiquetas de relé da sonda química amina para formar adutos covalentes.O grupo alquinilo da sonda química permite facer clic en química para o enriquecemento mediante o deselemento seguido da cuantificación LC-MS/MS.b Estrutura química das sondas de amina 1-4.c Análise representativa de xel fluorescente de marcadores proteómicos mediados por miniSOG localizados mitocondriais mediante as sondas 1-4 e cuantificación relativa baseada na densitometría en xel.A relación sinal a fondo das sondas químicas avaliouse mediante experimentos de control negativo excluíndo a luz azul ou utilizando células HEK293T sen expresión miniSOG.n = 2 mostras bioloxicamente independentes.Cada punto representa unha réplica biolóxica.d Detección e cuantificación representativas de PDPL mediante a sonda 3 optimizada en presenza ou ausencia dos compoñentes de PDPL indicados como c.n = 3 mostras bioloxicamente independentes.Cada punto representa unha réplica biolóxica.As liñas centrais e os bigotes representan a media e a desviación estándar ±.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Imaxe confocal de osíxeno singlete con tinción Si-DMA vermella afastada.Barra de escala: 10 µm.As imaxes en xel e os experimentos confocais repitéronse de forma independente polo menos dúas veces con resultados similares.
Primeiro probamos a capacidade dos fotosensibilizadores maduros miniSOG26 e KillerRed23, expresados de forma estable en HEK293T, para mediar o etiquetado con propargilamina do proteoma como sonda química (figura complementaria 1a).A análise de fluorescencia en xel mostrou que o marcado do proteoma completo se conseguiu mediante miniSOG e irradiación de luz azul, mentres que non se observou ningún produto de etiquetaxe visible con KillerRed.Para mellorar a relación sinal-fondo, logo probamos un conxunto de sondas químicas que conteñen anilina (1 e 3), propilamina (2) ou bencilamina (4).Observamos que as propias células HEK293T tiñan un sinal de fondo maior en comparación coa ausencia de luz azul, posiblemente debido ao fotosensibilizador da riboflavina endóxeno, o mononucleótido de flavina (FMN) 27 . As sondas químicas baseadas en anilina 1 e 3 deron mellor especificidade, con HEK293T que expresa de forma estable miniSOG nas mitocondrias mostrando un aumento de > 8 veces no sinal para a sonda 3, mentres que a sonda 2 usada no método de etiquetado de ARN CAP-seq só mostra ~2,5- aumento do sinal de dobra, probablemente debido a diferentes preferencias de reactividade entre o ARN e a proteína (Fig. 1b, c). As sondas químicas baseadas en anilina 1 e 3 deron mellor especificidade, con HEK293T que expresa de forma estable miniSOG nas mitocondrias mostrando un aumento de > 8 veces no sinal para a sonda 3, mentres que a sonda 2 usada no método de etiquetado de ARN CAP-seq só mostra ~2,5- aumento do sinal de dobra, probablemente debido a diferentes preferencias de reactividade entre o ARN e a proteína (Fig. 1b, c).As sondas químicas baseadas en anilina 1 e 3 mostraron unha mellor especificidade: HEK293T, que expresa de forma estable miniSOG nas mitocondrias, mostra un aumento de máis de 8 veces no sinal para a sonda 3, mentres que a sonda 2, usada no método de etiquetado de ARN CAP-seq, só mostra un aumento do sinal de ~ 2,5 veces, probablemente debido a diferentes preferencias de reactividade entre o ARN e a proteína (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 ， ， 而 用 于 标记 标记 标记 标记 标记 的 信号 增加 倍 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 ， ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 表达 ， ， ， ， 探针 3 的 增加 增加 增加 增加 增加 增加 增加 增加 倍 而 于 于 于 于 于 于 于 于 于 于 标记 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAs sondas químicas 1 e 3 baseadas en anilina tiñan mellor especificidade, HEK293T expresaba de forma estable o miniSOG nas mitocondrias e a sonda 3 tivo un aumento de máis de 8 veces no sinal, mentres que a sonda 2 para o método de etiquetado de ARN CAP-seq mostrou só un aumento de ~2,5 veces.no sinal, probablemente debido a diferentes preferencias de reacción entre ARN e proteína (Fig. 1b, c).Ademais, probáronse os isómeros da sonda 3 e as sondas de hidracina (sondas 5, 6, 7), confirmando a optimización da sonda 3 (figuras complementarias 1b, c).Do mesmo xeito, a análise de fluorescencia en xel revelou outros parámetros experimentais optimizados: lonxitude de onda de irradiación (460 nm), concentración da sonda química (1 mM) e tempo de irradiación (20 min) (figura complementaria 2a-c).Omitir calquera compoñente ou paso no protocolo PDPL provocou unha inversión significativa do sinal ao fondo (Fig. 1d).Notablemente, a etiquetaxe das proteínas reduciuse significativamente en presenza de azida de sodio ou trolox, que se sabe que apagan o osíxeno singlete.A presenza de D2O, que se sabe que estabiliza o osíxeno singlete, mellora o sinal de etiquetaxe.Para investigar a contribución doutras especies reactivas do osíxeno ao etiquetado, engadíronse manitol e vitamina C para establecer eliminadores de radicais hidroxilo e superóxido, respectivamente, 18, 29, pero non se atopou que reducen o etiquetado.A adición de H2O2, pero non a iluminación, non deu lugar á etiquetaxe (figura complementaria 3a).As imaxes de osíxeno singlete de fluorescencia con sondas Si-DMA confirmaron a presenza de osíxeno singlete no fío HEK293T-miniSOG, pero non no fío HEK293T orixinal.Ademais, o mitoSOX Red non puido detectar a produción de superóxido despois da iluminación (Fig. 1e e Fig. 3b complementaria) 30. Estes datos suxiren fortemente que o osíxeno singlete é a principal especie de osíxeno reactiva responsable do etiquetado proteómico posterior.A citotoxicidade do PDPL foi avaliada incluíndo irradiación de luz azul e sondas químicas, e non se observou citotoxicidade significativa (figura complementaria 4a).
Para estudar o mecanismo de etiquetaxe e permitir a identificación proteómica de complexos proteicos mediante LC-MS/MS, primeiro necesitamos determinar que aminoácidos se modifican e a masa delta das etiquetas das sondas.A metionina, a histidina, o triptófano e a tirosina foron modificados polo osíxeno singlete14,15.Integramos o fluxo de traballo TOP-ABPP31 coa busca aberta imparcial proporcionada pola plataforma informática FragPipe baseada en MSFragger32.Despois da modificación de osíxeno singlete e da etiquetaxe da sonda química, realizouse a química de clics usando unha etiqueta de redución de biotina que contén un enlazador escindible, seguido de estiramento de neutravidina e dixestión de tripsina.O péptido modificado, aínda unido á resina, foi fotoclivado para a análise LC-MS/MS (Figura 2a e datos suplementarios 1).Ocorreron un gran número de modificacións ao longo do proteoma con máis de 50 correspondencias do mapa de péptidos (PSM) listadas (Fig. 2b).Sorprendentemente, só observamos modificación da histidina, probablemente debido á maior reactividade da histidina oxidada cara a sondas de anilina que outros aminoácidos.Segundo o mecanismo publicado de oxidación da histidina por osíxeno singlete21,33, a estrutura delta-masa proposta de +229 Da corresponde ao aduto da sonda 3 con 2-oxo-histidina despois de dúas oxidacións, mentres que +247 Da é o produto da hidrólise. de +229 Da (figura complementaria 5).A avaliación do espectro MS2 mostrou unha alta fiabilidade na identificación da maioría dos ións y e b, incluíndo a identificación de ións fragmentos modificados (y e b) (Fig. 2c).A análise do contexto da secuencia local de histidinas modificadas con PDPL revelou unha preferencia de motivos moderada por pequenos residuos hidrofóbicos en posicións ± 1 (figura complementaria 4b).De media, identificáronse 1,4 histidinas por proteína e os sitios destes marcadores determináronse mediante a análise da superficie accesible ao disolvente (SASA) e da dispoñibilidade relativa do disolvente (RSA) (Figura complementaria 4c, d).
Un fluxo de traballo imparcial para estudar a selectividade residual usando a plataforma informática FragPipe impulsada por MSFragger.Os ligadores escindibles utilízanse na química Click para permitir a fotoclivaxe de péptidos modificados a partir da resina de estreptavidina.Lanzouse unha busca aberta para identificar numerosas modificacións, así como restos relevantes.b Asigne a masa de modificacións que se producen ao longo do proteoma.Mapeo de péptidos PSM.c Anotación espectral MS2 dos sitios de histidina modificados coa sonda 3. Como exemplo representativo, unha reacción covalente coa sonda 3 engadiu +229,0938 Da ao aminoácido modificado.d Ensaio de mutación usado para probar marcadores PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) e PRDX1 (H10A, H81A, H169A) transfectáronse con plásmidos de tipo salvaxe para a detección anti-Flag.e O péptido sintético reaccionou con miniSOG purificado en presenza da sonda 3 e os produtos correspondentes con Δm +247 e +229 notáronse no espectro LC-MS.f Interaccións proteína-proteína in vitro modeladas con miniSOG-6xHis-tag e anticorpo anti-6xHis.Análise de antibiotina (estreptavidina-HRP) e Western blot anti-rato de complexos de anticorpos miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcados coa sonda 3, dependendo do tempo de exposición á luz.As etiquetas das proteínas individuais exprésanse no peso molecular correspondente: cadea lixeira de anticorpos LC, cadea pesada de anticorpos HC.Estes experimentos repitéronse de forma independente polo menos dúas veces con resultados similares.
Para a verificación bioquímica do sitio de etiquetaxe, PRDX3 e PRDX1 identificados por espectrometría de masas cambiáronse de histidina a alanina e comparáronse co tipo salvaxe nos ensaios de transfección.Os resultados do PDPL mostraron que a mutación reduciu significativamente a etiquetaxe (Fig. 2d).Mentres tanto, as secuencias peptídicas identificadas na procura aberta foron sintetizadas e reaccionaron in vitro con miniSOG purificado en presenza da sonda 3 e luz azul, producindo produtos cun desprazamento de masa de +247 e +229 Da cando foron detectados por LC-MS (Fig. . 2e).).Para probar se as proteínas proximais que interactúan poderían etiquetarse in vitro en resposta á fotoactivación miniSOG, deseñamos un ensaio de proximidade artificial mediante a interacción entre a proteína miniSOG-6xHis e un anticorpo monoclonal anti-His in vitro (Figura 2f).Neste ensaio, esperabamos o marcado proximal das cadeas pesadas e lixeiras de anticorpos con miniSOG.De feito, as transferencias Western anti-rato (recoñecendo as cadeas pesadas e lixeiras de anticorpos marcados con anti-6xHis) e estreptavidina mostraron unha forte biotinilación das cadeas pesadas e lixeiras.Notablemente, observamos a autobiotinilación miniSOG debido á etiqueta 6xHis e ás ligazóns cruzadas entre cadeas lixeiras e pesadas, que poden estar relacionadas coa brecha anteriormente descrita entre a resposta proximal de lisina e 2-oxo-histidina.En conclusión, concluímos que o PDPL modifica a histidina de forma dependente da proximidade.
O noso seguinte obxectivo foi caracterizar o proteoma subcelular para probar a especificidade do etiquetado in situ.Polo tanto, expresamos miniSOG de forma estable no núcleo, na matriz mitocondrial ou na membrana ER externa das células HEK293T (Fig. 3a).A análise de fluorescencia en xel revelou abundantes bandas marcadas en tres lugares subcelulares, así como diferentes patróns de etiquetaxe (Fig. 3b).A análise de imaxes de fluorescencia mostrou unha alta especificidade de PDPL (Fig. 3c).O fluxo de traballo PDPL foi seguido de reaccións de clic con colorantes de rodamina para delinear proteomas subcelulares mediante microscopía de fluorescencia, e os sinais PDPL foron colocalizados con DAPI, rastreadores mitocondriais ou rastreadores ER, confirmando a alta fidelidade do PDPL.Para as tres localizacións dos orgánulos, unha comparación lado a lado de PDPL con TurboID usando avidin western blot mostrou que o PDPL estaba etiquetado máis específicamente en comparación cos seus respectivos controis.En condicións de PDPL, apareceron máis bandas marcadas, o que indicaba máis proteínas marcadas con PDPL (figura complementaria 6a-d).
a Representación esquemática do etiquetado de proteomas específicos de orgánulos mediado por miniSOG.miniSOG diríxese á matriz mitocondrial mediante a fusión cos 23 aminoácidos N-terminais da COX4 humana (mito-miniSOG), o núcleo mediante a fusión a H2B (núcleo-miniSOG) e Sec61β a través do lado citoplasmático da membrana ER (ER-miniSOG). ).As indicacións inclúen imaxe en xel, imaxe confocal e espectrometría de masas.b Imaxes de xel representativas de tres perfís de PDPL específicos de orgánulos.CBB Coomassie Azul Brillante.c Imaxes confocais representativas de células HEK293T que expresan de forma estable miniSOG con diferentes localizacións subcelulares detectadas polo anticorpo marcado V5 (vermello).Os marcadores subcelulares utilízanse para as mitocondrias e ER (verde).O fluxo de traballo PDPL inclúe a detección de proteomas subcelulares marcados con miniSOG (amarelo) mediante a química de clics de Cy3-azide.Barra de escala: 10 µm.d Gráficos volcánicos de proteomas marcados con PDPL en varios orgánulos cuantificados mediante cuantificación sen etiquetar (n = 3 experimentos biolóxicos independentes).A proba t de Student de dúas colas utilizouse en parcelas de volcáns.Utilizouse o tipo salvaxe HEK293T como control negativo. As proteínas modificadas significativamente están resaltadas en vermello (p < 0,05 e diferenza de intensidade iónica > 2 veces). As proteínas modificadas significativamente están resaltadas en vermello (p < 0,05 e diferenza de intensidade iónica > 2 veces). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интесни в интесо). As proteínas significativamente alteradas resáltanse en vermello (p < 0,05 e > 2 veces de diferenza na intensidade do ión).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлной ионлной). As proteínas significativamente alteradas destacan en vermello (p < 0,05 e > 2 veces a diferenza de forza iónica).As proteínas relacionadas importantes para HEK293T-miniSOG pero non importantes para HEK293T móstranse en verde.e Análise da especificidade dos conxuntos de datos proteómicos a partir de experimentos d.O número total de proteínas estatisticamente significativas en cada orgánulo (puntos vermellos e verdes) está marcado na parte superior.Os histogramas mostran proteínas localizadas en orgánulos baseándose en MitoCarta 3.0, análise GO e A. Ting et al.persoas.Conxuntos de datos separados para mitocondrias, núcleos e RE.Estes experimentos repitéronse de forma independente polo menos dúas veces con resultados similares.Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.
Animada polos resultados do xel e da imaxe, utilizouse a cuantificación sen etiquetas para cuantificar o proteoma identificado en cada orgánulo (datos suplementarios 2).Utilizouse HEK293T non transfectado como control negativo para restar marcadores de fondo. A análise da parcela do volcán mostrou proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 e > 2 veces de intensidade iónica), así como proteínas singleton que só están presentes nas liñas que expresan miniSOG (Fig. 3d puntos vermellos e verdes). A análise da parcela do volcán mostrou proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 e > 2 veces de intensidade iónica), así como proteínas singleton que só están presentes nas liñas que expresan miniSOG (Fig. 3d puntos vermellos e verdes). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). A análise da parcela do volcán mostrou proteínas significativamente enriquecidas (p<0,05 e > 2 veces a intensidade iónica), así como proteínas únicas que só están presentes nas liñas que expresan miniSOG (Fig. 3d, puntos vermellos e verdes).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子）） 以及 仅 存 在于 在于 在于 表达 表达 中 的 单一 （图 图 图 红色 红色 绿色点））。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 在于 在于 在于 在于 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 。。。 Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). A análise da parcela do volcán revelou proteínas significativamente enriquecidas (p<0,05 e > 2x forza iónica), así como proteínas únicas só presentes na liña de expresión miniSOG (puntos vermellos e verdes na figura 3d).Combinando estes datos, identificamos 1364, 461 e 911 proteínas da membrana externa nuclear, mitocondrial e ER estatisticamente significativas, respectivamente.Para analizar a precisión do PDPL localizado en orgánulos, utilizamos MitoCarta 3.0, análise de Gene Ontology (GO) e A. Ting et al.utilizouse un conxunto de datos8 para as mitocondrias, o núcleo e o RE para probar a especificidade dos orgánulos das proteínas detectadas, correspondentes a unha precisión do 73,4, 78,5 e 73,0% (Fig. 3e).A especificidade da PDPL confirma que a PDPL é unha ferramenta ideal para identificar proteomas específicos de orgánulos.Notablemente, a análise submitocondrial das proteínas mitocondriais identificadas mostrou que o proteoma atrapado distribuíuse principalmente na matriz e na membrana interna (226 e 106, respectivamente), representando o 91,7% (362) do número total de proteínas mitocondriais identificadas.confirmouse adicionalmente un alto nivel de PDPL (figura complementaria 7a).Do mesmo xeito, a análise subnuclear mostrou que o proteoma capturado distribuíuse principalmente no núcleo, nucleoplasma e nucleolo (figura complementaria 7b).A análise proteómica nuclear cun péptido sinal de localización nuclear (3xNLS) mostrou unha precisión similar á construción H2B (figura complementaria 7c-h).Para determinar a especificidade do marcador PDPL, escolleuse a laminina nuclear A como unha trampa POI7 localizada máis discretamente.PDPL identificou 36 proteínas significativamente enriquecidas, das cales 12 proteínas (o 30,0% incluída a lamina A) eran proteínas que interactuaban con lamina A ben caracterizadas anotadas pola base de datos String, cunha porcentaxe máis alta que o método BioID (122 proteínas) 28 de 28. , 22.9 %) 7. O noso método identificou menos proteínas, posiblemente debido a áreas de marcaxe limitadas, o que foi posible grazas ao osíxeno singlete máis activo.A análise GO mostrou que as proteínas identificadas localizáronse principalmente no nucleoplasma (26), membrana nuclear (10), membrana nuclear (9) e poros nucleares (5).Colectivamente, estas proteínas localizadas nuclearmente representaron o 80% das proteínas enriquecidas, demostrando aínda máis a especificidade do PDPL (figuras complementarias 8a-d).
Unha vez establecida a capacidade do PDPL para realizar marcas de proximidade en orgánulos, probamos se o PDPL podía usarse para analizar os socios de unión de POI.En particular, buscouse definir a análise PDPL das proteínas citosólicas, que se consideran dianas máis difíciles que as súas contrapartes localizadas na membrana debido á súa natureza altamente dinámica.A proteína bromodomain e extraterminal (BET) BRD4 chamou a nosa atención polo seu papel fundamental en diversas enfermidades 35, 36 .O complexo formado por BRD4 é un coactivador transcripcional e unha diana terapéutica importante.Ao regular a expresión dos factores de transcrición c-myc e Wnt5a, pénsase que BRD4 é un determinante clave da leucemia mieloide aguda (AML), o mieloma múltiple, o linfoma de Burkitt, o cancro de colon e as enfermidades inflamatorias37,38.Ademais, algúns virus teñen como obxectivo o BRD4 para regular a transcrición viral e celular, como o virus do papiloma, o VIH e o SARS-CoV-236,39.
Para mapear a interacción BRD4 usando PDPL, combinamos miniSOG cunha isoforma N- ou C-terminal curta de BRD4.Os resultados proteómicos revelaron un alto grao de superposición entre as dúas construcións (figura complementaria 9a).O proteoma nuclear identificado con miniSOG-H2B cobre o 77,6% das proteínas que interactúan con BRD4 (figura complementaria 9b).Despois, utilizáronse diferentes tempos de iluminación (2, 5, 10, 20 min) para axustar o raio do marcador (Fig. 4a e datos complementarios 3).Concluímos que en fotoperíodos máis curtos, o PDPL marcará principalmente os socios de unión directa, mentres que os períodos máis longos incluirán proteínas identificadas durante períodos de fotoactivación máis curtos, así como dianas indirectas nos complexos de etiquetaxe.De feito, atopamos unha forte superposición entre os puntos de tempo adxacentes (84,6% durante 2 e 5 min; 87,7% durante 5 e 10 min; 98,7% durante 10 e 20 min) (Fig. 4b e Fig. 9c complementaria).En todos os grupos experimentais, atopamos non só a autoetiquetado BRD4, senón varios obxectivos coñecidos como MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A e HMGB1 anotados na base de datos de cadeas.A forza iónica destes obxectivos é proporcional ao tempo de exposición (figura 4c e figura complementaria 9d).A análise GO das proteínas identificadas no grupo de 2 minutos mostrou que as proteínas identificadas estaban localizadas no núcleo e estaban implicadas na remodelación da cromatina e na función da ARN polimerase.A función molecular da proteína foi enriquecida na unión da cromatina ou na coactivación transcripcional, de acordo coa función BRD4 (Fig. 4d).A análise de interaccións proteicas habilitadas na base de datos de cadeas revelou un primeiro nivel de interaccións indirectas entre os complexos de interacción da familia BRD4 e HDAC como SIN3A, NCOR2, BCOR e SAP130 (Fig. 4e e Fig. 9e complementaria), consistente coas histonas acetiladas que unen BRD4 e HDAC. ..Ademais, os obxectivos representativos identificados por LC-MS/MS, incluíndo Sin3A, NSUN2, Fus e SFPQ, foron confirmados por Western Blotting (Fig. 4f).Recentemente, informouse que a isoforma curta de BRD4 forma núcleos con propiedades de separación de fase líquido-líquido (LLPS).As proteínas de unión ao ARN Fus e SFPQ median o LLPS de varios procesos celulares e identificáronse aquí como proteínas de unión a BRD4 non rexistradas.A interacción entre BRD4 e SFPQ confirmouse mediante experimentos de co-inmunoprecipitación (co-IP) (Figura 4g), o que suxire outro mecanismo para a separación de fase líquido-líquido mediada por BRD4 que merece máis investigación.En conxunto, estes resultados suxiren que o PDPL é unha plataforma ideal para identificar proteínas de unión descoñecidas que interactúan con BRD4.
a Representación esquemática da marca de proximidade BRD4 mediada por miniSOG, tempos de exposición: 2, 5, 10 e 20 min.b Superposición de proteínas identificadas en diferentes momentos de iluminación.O enriquecemento de proteínas identificado en HEK293T-miniSOG-BRD4 foi estatisticamente significativo en comparación co HEK293T de tipo salvaxe.c Intensidade do ión ao cuantificar proteínas de unión a BRD4 representativas non marcadas coñecidas durante o tempo de exposición especificado.n = 3 mostras bioloxicamente independentes.Os datos preséntanse como media ± desviación estándar.d Análise ontolóxica xenética (GO) das proteínas identificadas no grupo de 2 minutos.Enuméranse os dez primeiros termos GO.As burbullas están coloreadas segundo a categoría de termos GO, e o tamaño das burbullas é proporcional ao número de proteínas atopadas en cada termo.e Análise de cadeas de proteínas que interactúan con BRD4.Os círculos amarelos son cola directa e os círculos grises son a primeira capa de cola indirecta.As liñas vermellas representan as interaccións determinadas experimentalmente e as azuis as interaccións previstas.f Os obxectivos de unión BRD4 representativos identificados en LC-MS/MS foron verificados mediante transferencia Western.g Os experimentos de co-inmunoprecipitación confirman a interacción entre SFPQ e BRD4.Estes experimentos repitéronse de forma independente polo menos dúas veces con resultados similares.Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.
Ademais de identificar dianas asociadas a POI non rexistradas, a hipótese de que o PDPL será axeitado para identificar substratos para encimas, o que requiriría a caracterización de proteínas de unión indirecta en grandes complexos para anotar substratos non rexistrados.A parkina (codificada por PARK2) é unha ligase E3 e sábese que as mutacións na parkina causan a enfermidade de Parkinson xuvenil autosómica recesiva (AR-JP)42.Ademais, a parkin foi descrita como esencial para a mitofaxia (autofaxia mitocondrial) e a eliminación de especies reactivas do osíxeno.Non obstante, aínda que se identificaron varios substratos de parkin, o papel da parkin nesta enfermidade segue sen estar claro.Para anotar os seus substratos non caracterizados, probouse o PDPL engadindo miniSOG ao extremo N ou C-terminal da parkin.As células foron tratadas co transportador de protóns de cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP) para activar a parkina a través da vía PINK1-Parkin.En comparación cos resultados do noso BRD4 PDPL, a fusión do parkin N-terminal revelou un conxunto maior de proteínas diana, aínda que cubriu unha parte máis grande do extremo C-terminal (177 de 210) (Figura 5a,b e Datos suplementarios 4).o resultado é consistente cos informes de que as etiquetas N-terminais poden activar Parkin44 de forma aberrante.Sorprendentemente, só había 18 proteínas superpostas nos nosos datos cos resultados publicados de AP-MS para Parkin43, probablemente debido ás diferenzas entre liñas celulares e fluxos de traballo de proteómica.Ademais de catro proteínas coñecidas (ARDM1, HSPA8, PSMD14 e PSMC3) identificadas por dous métodos (Fig. 5c)43.Para validar aínda máis os resultados de LC-MS/MS, utilizáronse o tratamento con PDPL e a posterior transferencia Western para comparar os resultados do ensaio de células nai HEK293T e a liña de parkin N-terminal estable.Os obxectivos CDK2, DUT, CTBP1 e PSMC4 previamente descoñecidos foron probados cun aglutinante coñecido, DNAJB1 (Fig. 5d).
Gráfica de volcáns de proteínas que interactúan coa parkina en células HEK293T con miniSOG expresado de forma estable fusionada ao extremo N ou C da parkina (n = 3 experimentos biolóxicos independentes).A proba t de Student de dúas colas utilizouse en parcelas de volcáns.HEK293T utilizouse como control negativo. As proteínas modificadas significativamente están resaltadas en vermello (p < 0,05 e diferenza de intensidade iónica > 2 veces). As proteínas modificadas significativamente están resaltadas en vermello (p < 0,05 e diferenza de intensidade iónica > 2 veces). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интесни в интесо). As proteínas significativamente alteradas resáltanse en vermello (p < 0,05 e > 2 veces de diferenza na intensidade do ión).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлной ионлной). As proteínas significativamente alteradas destacan en vermello (p < 0,05 e > 2 veces a diferenza de forza iónica).As proteínas relacionadas importantes para HEK293T-miniSOG pero non importantes para HEK293T móstranse en verde.b Diagrama de Venn que mostra proteínas superpostas entre as construcións N-terminais e C-terminais.As etiquetas N-terminais poden activar a parquina de forma aberrante e dar lugar a proteínas máis recoñecibles.c Diagrama de Venn que mostra proteínas superpostas entre PDPL e AP-MS.Enuméranse os interactores coñecidos, incluíndo 4 das 18 proteínas superpostas e 11 das 159 proteínas identificadas especificamente no PDPL.d Os obxectivos representativos identificados por LC-MS/MS foron verificados mediante Western Blotting.e Ssu72 e SNW1 identificáronse como substratos de parkin non rexistrados.Estes plásmidos proteicos marcados con FLAG transfectáronse en HEK293T e HEK293T-Parkin-miniSOG seguidos de tratamento con CCCP en varios momentos.A degradación foi máis pronunciada na liña de sobreexpresión de Parkin.f Usando o inhibidor do proteasoma MG132, confirmouse que o proceso de degradación de Ssu72 e SNW1 está mediado pola ubiquitinación do proteasoma.Estes experimentos repitéronse de forma independente polo menos dúas veces con resultados similares.Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.
En particular, as proteínas identificadas pola PDPL deben incluír proteínas de unión á parquina e os seus substratos.Para detectar substratos de parkin non rexistrados, seleccionamos sete proteínas identificadas (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 e SNW1) e plásmidos transfectados para expoñer estes xenes a HEK293T normal e expresar de forma estable o HEK293T de miniSOG-Parkin seguido do tratamento con CCCP.Os niveis de proteínas Ssu72 e SNW1 reducíronse significativamente na liña estable miniSOG-Parkin (Fig. 5e).O tratamento con CCCP durante 12 horas deu lugar á degradación máis significativa de ambos substratos.Para investigar se a degradación de Ssu72 e SNW1 está regulada pola ubiquitinación do proteasoma, engadiuse o inhibidor do proteasoma MG132 para inhibir a actividade do proteasoma e, de feito, descubrimos que o seu proceso de degradación estaba inhibido (Fig. 5f).Confirmáronse obxectivos adicionais que non son de substrato como interactores de Parkin mediante Western blotting (figura complementaria 10), que mostrou resultados consistentes con LC-MS/MS.En conclusión, a integración do fluxo de traballo PDPL coa verificación da transfección da proteína diana permite a identificación de substratos de ligase E3 non rexistrados.
Desenvolvemos unha plataforma común de marcado de proximidade que permite identificar no espazo e no tempo os PDI interactivos.A plataforma baséase na proteína fotosensibilizadora miniSOG, que ten só uns 12 kDa, menos da metade do tamaño da encima APEX2 madura (27 kDa) e un terzo do tamaño do TurboID (35 kDa).O tamaño máis pequeno debería ampliar moito o abano de aplicacións para estudar interactomas de proteínas pequenas.É necesaria unha exploración adicional de fotosensibilizadores adicionais, xa sexan proteínas codificadas xeneticamente ou moléculas pequenas, para aumentar o rendemento cuántico de osíxeno singlete e ampliar a sensibilidade deste enfoque.Para a versión actual de miniSOG, pódese conseguir unha alta resolución temporal usando iluminación azul para activar os marcadores de proximidade.Ademais, un tempo de exposición máis longo lanzou unha "nube" maior de osíxeno singlete, o que provocou a modificación de residuos de histidina máis distais, un aumento do radio de etiquetaxe e a capacidade de afinar a resolución espacial do PDPL.Tamén probamos sete sondas químicas para aumentar a relación sinal-fondo e exploramos o mecanismo molecular detrás deste enfoque.O fluxo de traballo TOP-ABPP combinado coa busca aberta imparcial confirmou que só se produciron modificacións nas histidinas e que non se observou ningún microambiente consistente para aumentar as modificacións da histidina, agás unha preferencia moderada polas histidinas na rexión do bucle.
O PDPL tamén se utilizou para caracterizar proteomas subcelulares con especificidade de proteoma e cobertura polo menos comparable a outros métodos de marcado de proximidade e sondas químicas específicas de orgánulos.Os marcadores de proximidade tamén se utilizaron con éxito para caracterizar os proteomas de superficie, lisosómicos e asociados ao secretoma46,47.Cremos que o PDPL será compatible con estes orgánulos subcelulares.Ademais, desafiamos a PDPL identificando dianas para a unión de proteínas citosólicas que son máis complexas que as proteínas unidas á membrana debido ás súas propiedades dinámicas e á implicación en interaccións máis temporais.A PDPL aplicouse a dúas proteínas, o coactivador transcripcional BRD4 e a ligase E3 Parkin asociada á enfermidade.Estas dúas proteínas foron escollidas non só polas súas funcións biolóxicas fundamentais, senón tamén pola súa relevancia clínica e potencial terapéutico.Para estes dous PDI, identificáronse socios vinculantes coñecidos así como obxectivos non rexistrados.Notablemente, a proteína SFPQ asociada á separación de fases foi confirmada por co-IP, o que pode indicar un novo mecanismo polo cal BRD4 (isoforma curta) regula a LLPS.Ao mesmo tempo, cremos que a identificación de substratos de Parkin é un escenario no que se require a identificación de adhesivos indirectos.Identificamos dous substratos de parkin non identificados e confirmamos a súa degradación ao longo da vía de ubiquitinación-proteasoma.Recentemente, desenvolveuse unha estratexia de captura baseada en mecanismos para detectar substratos de hidrolasa atrapándoos con encimas.Aínda que este é un método moi potente, non é adecuado para a análise de substratos implicados na formación de grandes complexos e require a formación de enlaces covalentes entre o encima e o substrato.Esperamos que o PDPL poida estenderse para estudar outros complexos proteicos e familias de encimas, como as familias deubiquitinase e metaloprotease.
Desenvolveuse unha nova forma de miniSOG, chamada SOPP3, coa produción de osíxeno singlete mellorada.Comparamos miniSOG con SOPP3 e atopamos un rendemento de marcado mellorado, aínda que a relación sinal-ruído permaneceu inalterada (Imaxe complementaria 11).A hipótese de que a optimización de SOPP3 (por exemplo, a través da evolución dirixida) levaría a proteínas fotosensibilizadoras máis eficientes que requiren tempos de luz máis curtos e, polo tanto, permitirían capturar procesos celulares máis dinámicos.En particular, a versión actual de PDPL está limitada ao ambiente celular xa que require iluminación azul e non pode penetrar nos tecidos profundos.Esta característica impide o seu uso en estudos de modelos animais.Non obstante, a combinación de optoxenética con PDPL podería proporcionar unha oportunidade para a investigación en animais, especialmente no cerebro.Ademais, outros fotosensibilizadores infravermellos de enxeñería tamén eliminan esta limitación.Actualmente está en marcha investigacións neste ámbito.
A liña celular HEK293T obtívose de ATCC (CRL-3216).A liña celular resultou negativa para a infección por micoplasma e cultivouse en DMEM (Thermo, #C11995500BT) complementado con 10% de soro fetal bovino (FBS, Vistech, #SE100-B) e 1% de penicilina/estreptomicina (Hyclone, #SV30010).medrado en.
3-Aminofenileno (mostra 3) e (4-etinilfenil)metanamina (mostra 4) foron adquiridos de Bidepharm.A propilamina (sonda 2) foi adquirida de Energy-chemicals.Sintetizouse a N-(2-aminofenil)pent-4-inamida (sonda 1) segundo métodos publicados.
A táboa complementaria 1 enumera as construcións xenéticas utilizadas neste estudo.As secuencias miniSOG e KillerRed foron clonadas a partir dun plásmido regalo de P. Zou (Universidade de Pequín).A secuencia de destino da matriz mitocondrial derivouse dos 23 aminoácidos N-terminais de COX4 e clonouse nos vectores indicados mediante un conxunto de Gibson (Beyotime, #D7010S).Para dirixir a membrana e o núcleo do retículo endoplasmático, o ADN humano SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificado por PCR dunha biblioteca de cDNA de células HEK293T e ADN H2B (doado por D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) e clonado, como se mencionou anteriormente.A menos que se indique o contrario, outros xenes proteicos usados para a transfección e construción de liñas celulares estables foron amplificados por PCR a partir da biblioteca de ADNc de células HEK293T.Utilizáronse G3S (GGGS) e G4S (GGGGS) como enlaces entre a proteína do cebo e o miniSOG.A estas construcións de fusión engadiuse unha etiqueta de epítopo V5 (GKPIPNPLLGLDST).Para a expresión en mamíferos e para establecer unha liña celular estable, o constructo de fusión miniSOG foi subclonado no vector lentiviral pLX304.Para a expresión bacteriana, o miniSOG foi clonado no vector pET21a marcado 6xHis no extremo C-terminal.
As células HEK293T sementáronse a 2,0 x 105 células por pozo en placas de seis pocillos e transfectáronse 24 horas despois con plásmidos lentivirais recombinantes (2,4 μg pLX304) e plásmidos de envasado viral (1,5 μg psPAX2 e 1,2 μg pMD290G) con pMD2. , #C0533), preto do 80 % de fusión.Despois da transfección durante a noite, cambiouse o medio e incubouse durante outras 24 horas.A recollida do virus realizouse ás 24, 48 e 72 horas.Antes da infección das liñas celulares diana, o medio viral filtróuse a través dun filtro de 0,8 μm (Merck, #millex-GP) e engadiuse polibreno (Solarbio, #H8761) a unha concentración de 8 μg/ml.Despois de 24 horas, permitíronse que as células se recuperasen cambiando o medio.Seleccionáronse as células usando 5 μg/ml de blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) para as tres primeiras pasaxes como unha selección máis rigorosa.Despois utilizouse 20 μg/ml como un réxime máis estrito para as tres seguintes pasaxes.
As células sementáronse en cámaras de 12 pozos (Ibidi, #81201) cunha densidade de aproximadamente 20.000 células por pozo.Para mellorar a adhesión das células HEK293T, engade 50 µg/ml de fibronectina (Corning, #356008) diluída en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Sangon, #B640435) a 37 °C.As cámaras foron pretratadas durante 1 hora e despois retiráronse con PBS.Despois de 24 h, as células laváronse unha vez con PBS, incubáronse cunha sonda 3 1 mM en solución salina equilibrada de Hanks fresca (HBSS, Gibco, #14025092) durante 1 h a 37 °C e despois incubáronse cun LED azul (460 nm). ).) irradiáronse durante 10 min a temperatura ambiente.Despois diso, as células foron lavadas dúas veces con PBS e fixadas con formaldehido ao 4% en PBS (Sangon, #E672002) durante 15 minutos a temperatura ambiente.O exceso de formaldehido foi eliminado das células fixas lavando tres veces con PBS.Despois permeabilizáronse as células con Triton X-100 ao 0,5% (Sangon, #A600198) en PBS e laváronse 3 veces con PBS.A continuación, retire a cámara e engade a cada mostra 25 µl dunha mestura de reacción clic que contén 50 µM de Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM de CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM de BTTAA (Confluore, #BDJ-4) e 0,5 mg/ml de ascorbato de sodio (Aladdin, no S105024) e incubáronse durante 30 minutos a temperatura ambiente.Despois dunha reacción rápida, as células laváronse seis veces con PBS que contiña 0,05% de Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) e despois bloqueáronse con 5% de BSA (Abcone, #B24726) en PBST durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Para a inmunotinción de colocalización, as células foron incubadas con anticorpos primarios segundo as condicións indicadas: mAb de etiqueta de rato anti-V5 (1:500, CST, #80076), mAb de coello anti-Hsp60 (1:1000), ABclonal, #A0564), anticorpo policlonal anti-calnexina de coello (1:500, Abcam, #ab22595) ou anticorpo monoclonal anti-lamina A/C de coello (1:500; CST, #2032) a 4 °C durante a noite.Despois de lavar 3 veces con PBST, as células foron incubadas con anticorpos secundarios: Alexa Fluor 488 anti-coello de cabra (Thermo, #A11034) diluído 1:1000, Alexa Fluor 594 anti-rato de cabra (CST, #8889) diluído 1:1000.dilución Diluír a temperatura ambiente durante 30 minutos.A continuación, lavaron as células 3 veces con PBST e tinxironse con DAPI (Thermo, #D1306) en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Despois de 3 lavados con PBS, as células seláronse en glicerol ao 50% (Sangon, #A600232) en PBS para a obtención de imaxes.As imaxes inmunofluorescentes obtivéronse mediante un microscopio confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 e o software ZNE 3.5.
Para a imaxe fluorescente de osíxeno singlete, as células laváronse dúas veces con tampón HEPES de Hanks antes de engadir 100 nM de Si-DMA no tampón HEPES de Hanks (DOJINDO, #MT05).Despois da exposición á luz, as células foron incubadas nunha incubadora de CO2 a 37 °C durante 45 minutos.A continuación, lavaron as células dúas veces co tampón HEPES de Hanks e tinxironse con Hoechst en tampón HEPES de Hanks durante 10 minutos a temperatura ambiente e visualizáronse cun microscopio confocal ZEISS LSM 900., #M36008) en tampón HBSS que contén calcio e magnesio.Despois da exposición á luz ou á doxorrubicina (MCE, #HY-15142A), incubáronse as células nunha incubadora de CO2 a 37 °C durante 10 minutos, laváronse dúas veces con tampón HBSS e incubáronse con Hoechst en tampón HBSS a temperatura ambiente.minutos.A doxorrubicina utilizouse como un control de sonda positivo onde as células foron tratadas con doxorrubicina 20 μM en HBSS que contiña 1% de BSA durante 30 min.As imaxes inmunofluorescentes obtivéronse mediante un microscopio confocal Zeiss LSM 900.
As células HEK293T que expresan de forma estable mito-miniSOG sementáronse cunha densidade de aproximadamente un 30% en pratos de 15 cm.Despois de 48 horas, cando se alcanzou a confluencia de ~ 80%, as células foron lavadas unha vez con PBS, incubáronse cunha sonda 3 1 mM en tampón HBSS fresco durante 1 hora a 37 °C e despois ilumináronse cun LED azul durante 10 minutos na habitación. temperatura..Despois, as células foron lavadas dúas veces con PBS, raspadas e resuspendidas nun tampón PBS xeado que contén inhibidores da protease sen EDTA (MCE, #HY-K0011).As células foron lisadas sonicando a punta durante 1 minuto (1 segundo acendido e 1 segundo apagado ao 35 % de amplitude).A mestura resultante centrifugouse a 15.871 xg durante 10 min a 4 °C para eliminar os restos e a concentración do sobrenadante axustouse a 4 mg/ml usando un kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, #P0009).Combina 1 ml do lisado anterior con azida de biotina fotodegradable 0,1 mM (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), ligando TBTA 0,1 mM (Aladdin, #T162437) e incubadora de CuSO4 1 mM con fondo. rotación durante 1 hora a temperatura ambiente.Despois dunha reacción rápida, engade a mestura á solución premesturada (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) nun vial de vidro de 10 ml.As mostras mesturáronse e centrifugáronse a 4500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Desbotáronse as solucións inferior e superior, o precipitado lavouse dúas veces con 1 ml de metanol e centrifugouse a 15871 × g durante 5 min a 4 °C.Engade 1 ml de urea 8 M (Aladdin, no U111902) en bicarbonato de amonio 25 mM (ABC, Aladdin, no A110539) para disolver o precipitado.As mostras reconstituíronse con ditiotreitol 10 mM (Sangon, #A100281 en 25 mM ABC) durante 40 minutos a 55 °C seguido da adición de iodoacetamida fresca 15 mM (Sangon, #A600539) a temperatura ambiente na escuridade.Alquilación en 30 minutos..Engadiuse un adicional de ditiotreitol 5 mM para deter a reacción.Prepare aproximadamente 100 µl de perlas de agarosa de NeutrAvidin (Thermo, #29202) para cada mostra lavando 3 veces con 1 ml de PBS.A solución de proteoma anterior diluíuse con 5 ml de PBS e incubouse con perlas de agarosa de NeutrAvidin previamente lavadas durante 4 horas a temperatura ambiente.A continuación, laváronse as perlas 3 veces con 5 ml de PBS que contén 0,2% de SDS (Sangon, #A600485), 3 veces con 5 ml de PBS que contén 1M de urea e 3 veces con 5 ml de ddH2O.A continuación, recolléronse as perlas por centrifugación e volvéronse en suspensión en 200 μl de ABC 25 mM que contén 1 M de urea, 1 mM de CaCl 2 (Macklin, # C805228) e 20 ng/μl de tripsina (Promega, # V5280).Tripsinizar durante a noite a 37 °C con rotación.A reacción detívose engadindo ácido fórmico (Thermo, # A117-50) ata que o pH chegou a 2-3.As perlas laváronse 3 veces con 1 ml de PBS que contén 0,2% de SDS, 3 veces con 1 ml de PBS que contén 1 M de urea e, a continuación, 3 veces con 1 ml de auga destilada.Os péptidos modificados foron liberados por lise lixeira (365 nm) durante 90 min usando 200 μl de MeOH ao 70%.Despois da centrifugación, recolleuse o sobrenadante.A continuación, laváronse as perlas unha vez con 100 μl de MeOH ao 70% e reuníronse os sobrenadantes.As mostras secáronse nun concentrador de baleiro Speedvac e almacenáronse a -20 °C ata a súa análise.
Para identificar e cuantificar os péptidos modificados con osíxeno singlete, redisolvéronse mostras en ácido fórmico ao 0,1% e analizáronse 1 μg de péptidos utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado cunha fonte nano ESI de Tune e Xcalibur do software do vendedor 4.3.As mostras separáronse nunha columna capilar empaquetada internamente de 75 µm × 15 cm con material C18 de 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) e conectáronse a un sistema UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo).Os péptidos separáronse mediante cromatografía lineal de gradiente de 95 minutos desde o 8% de disolvente B ata o 50% de disolvente B (A = 0,1% de ácido fórmico en auga, B = 0,1% de ácido fórmico en 80% de acetonitrilo), despois aumentando linealmente ata o 98% de B min. en 6 min a un caudal de 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos recolle datos alternativamente entre a exploración completa de MS e a exploración MS2 dependendo dos datos.A tensión de pulverización catódica estableceuse en 2,1 kV e a temperatura do capilar de transporte iónico foi de 320 °C.Recolléronse espectros MS (350-2000 m/z) cunha resolución de 120.000, AGC 4 × 105 e un tempo de entrada máximo de 150 ms.Os 10 precursores de carga múltiple máis comúns en cada exploración completa foron fragmentados usando HCD cunha enerxía de colisión normalizada do 30%, unha xanela de illamento cuadrupolar de 1,6 m/z e unha configuración de resolución de 30.000.Un obxectivo AGC para espectrometría de masas en tándem usando 5×104 e un tempo de entrada máximo de 150 ms.A excepción dinámica está establecida en 30 segundos. Os ións non asignados ou aqueles cunha carga de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS. Os ións non asignados ou aqueles cunha carga de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Os ións non asignados ou cunha carga de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Os ións non especificados ou con cargas de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS.
Os datos en bruto son procesados mediante a plataforma informática FragPipe baseada en MSFragger.Os sesgos de masa e os correspondentes aminoácidos determináronse mediante un algoritmo de busca aberta cunha tolerancia á masa do precursor de -150 a 500 Da.Os péptidos modificados identificáronse entón mediante modificacións de histidina con ganancias de masa de +229,0964 e +247,1069 Da en PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
As células que expresaban de forma estable o xene miniSOG fusionado colocáronse en placas de 6 cm.Ao alcanzar a confluencia de ~80%, as células laváronse unha vez con HBSS (Gibco, #14025092), despois incubáronse con sondas químicas en HBSS durante 1 hora a 37 °C e ilumináronse con luz azul.LED de 10 W durante 20 minutos a temperatura ambiente.Para determinar que tipo de especies reactivas de oxíxeno está implicada en PDPL, vitamina C 0,5 mM (MCE, #HY-B0166), Trolox 5 mM (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Engadíronse ás células 100 mM de manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM de H2O2, 10 mM de NaN3 como suplementos.Despois de lavar con PBS frío, as células foron raspadas, recollidas en tubos de centrífuga de 1,5 ml e sonicadas cunha punta durante 1 min en 200 μl de PBS con inhibidor de protease 1x sen EDTA (1 s e 1 s sen, amplitude 35%).A mestura resultante centrifugouse a 15.871 × g durante 10 min a 4 °C e a concentración do sobrenadante axustouse a 1 mg/ml usando un kit de ensaio de proteína BCA.Aproximadamente 50 µl do lisado anterior incubáronse con azida de rodamina 0,1 mM (Aladdin, no. T131368), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM e CuSO4 1 mM durante 1 hora a temperatura ambiente con rotación de abaixo cara arriba.Despois da reacción de clic, levouse a cabo a precipitación con acetona engadindo 250 μl de acetona pre-refriada ás mostras, incubando a -20 °C durante 20 min e centrifugando a 6010 × g durante 10 min a 4 °C.Recoller o pellet e ferver en 50 µl de tampón de Laemmli 1x durante 10 min a 95 °C.Despois analizáronse as mostras en xeles longos SDS-PAGE e visualizáronse mediante o sistema de imaxe Bio-rad ChemiDoc MP Touch co software Image Lab Touch.
A expresión e purificación da proteína recombinante miniSOG-6xHis realizouse como se describiu anteriormente.Brevemente, as células BL21(DE3) de E. coli (TransGen, #CD701-02) transformáronse con pET21a-miniSOG-6xHis e a expresión da proteína foi inducida con IPTG 0,5 mM (Sangon, #A600168).Despois da lise celular, as proteínas purificáronse utilizando perlas de agarosa Ni-NTA (MCE, no 70666), dializaron contra PBS e almacenáronse a -80 °C.
Para un ensaio de proximidade de etiquetado in vitro baseado en anticorpos, mestura 100 μM de miniSOG purificado, 1 mM de sonda 3 e 1 μg de anticorpo monoclonal de rato anti-etiqueta (TransGen, #HT501-01) en PBS ata un volume de reacción total de 50 μl..A mestura de reacción irradiouse con luz LED azul durante 0, 2, 5, 10 e 20 min a temperatura ambiente.A mestura foi incubada con biotina-PEG3-azida 0,1 mM (Aladdin, #B122225), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM e CuSO4 1 mM durante 1 h a temperatura ambiente nun agitador de movemento ascendente.Despois dunha reacción rápida, engade 4x tampón de Laemmli directamente á mestura e ferva a 95 °C durante 10 min.As mostras analizáronse en xeles SDS-PAGE e analizáronse mediante transferencia western con estreptavidina-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Utilizouse un péptido sintético que contén histidina con amidación C-terminal (LHDALDAK-CONH2) para analizar o marcado in vitro baseado en péptidos próximos.Neste ensaio mesturáronse 100 μM de miniSOG purificado, 10 mM de sonda 3 e 2 μg/ml de péptido sintético en PBS nun volume de reacción total de 50 μl.A mestura de reacción foi irradiada con luz LED azul durante 1 hora a temperatura ambiente.Analizouse un microlitro de mostra mediante un sistema LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight espectrómetro de masas con software de análise de espectro MassLynx).
As células HEK293T que expresan de forma estable o xene de fusión miniSOG sementáronse en pratos de 10 cm para liñas con diferentes localizacións de orgánulos (Mito, ER, Nucleus) e pratos de 15 cm para liñas Parkin-miniSOG e BRD4-miniSOG.Ao alcanzar a confluencia de ~ 90%, as células laváronse unha vez con HBSS, despois incubáronse coa sonda 3 en HBSS durante 1 hora a 37 °C e ilumináronse cun LED azul de 10 W a temperatura ambiente.Para o etiquetado sen contacto de Parkin, engadiuse 10 µM de portador de cianuro de carbonilo protón m-clorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) coa sonda 3 en HBSS durante 1 hora a 37 °C.As etapas de lise celular, química de clic, redución e alquilación foron as mesmas descritas anteriormente, excepto que se engadiron 2 mg de lisado e na reacción de clic utilizouse azida de biotina PEG3 en lugar da azida de biotina fotodegradable.Despois do enriquecemento, as perlas laváronse 3 veces con 5 ml de PBS que contén 0,2% de SDS, 3 veces con 5 ml de PBS que contén 1 M de urea e 3 veces con 5 ml de PBS.Despois, engadíronse 2 µg de tripsina a 300 µl de ABC 25 mM que conteñen 1 M de urea para escindir a proteína durante a noite a 37 °C.A reacción detívose engadindo ácido fórmico ata alcanzar un pH de 2-3.Despois da tripsinización en perlas, a solución peptídica desalouse usando unha columna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) e secouse nun concentrador de baleiro Speedvac.Os péptidos redisolvéronse en ácido fórmico ao 0,1% e analizáronse 500 ng de péptidos utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado coa fonte nano-ESI descrita anteriormente.Os péptidos separáronse en precolumnas comerciais de RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, no 164946) e columnas analíticas RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, no 164941), ambas cheas de 2 μm.gradiente do 8% ao 35% de ACN en 60 minutos, despois aumentou linealmente ata o 98% B en 6 minutos a un caudal de 300 Nl/min.Recolléronse espectros MS (350-1500 m/z) cunha resolución de 60.000, AGC 4 × 105 e un tempo de entrada máximo de 50 ms.Os ións seleccionados foron fragmentados secuencialmente por HCD en ciclos de 3 s cunha enerxía de colisión normalizada do 30%, unha xanela de illamento cuadrupolar de 1,6 m/z e unha resolución de 15000. Un obxectivo AGC de espectrómetro de masas en tándem de 5 × 104 e un tempo de inxección máximo. de 22 ms foron utilizados.A exclusión dinámica está definida en 45 segundos. Os ións non asignados ou aqueles cunha carga de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS. Os ións non asignados ou aqueles cunha carga de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Os ións non asignados ou cunha carga de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ e >7+ были отклонены для МС/МС. Os ións non especificados ou con cargas de 1+ e >7+ foron rexeitados para MS/MS.
Os pasos de preparación da mostra ata o enriquecemento das perlas de NeutrAvidin foron os mesmos que na análise LC-MS/MS descrita anteriormente.Utilizáronse aproximadamente 50 μg de lisado como entrada para o control de carga e 2 mg de lisado para as reaccións de clic.Tras o enriquecemento e o lavado con neutravidina, as proteínas unidas eluíronse engadindo 50 μl de tampón de Laemmli ás perlas de resina de agarosa e fervendo a 95 °C durante 5 minutos.A entrada de carga de control e as mostras enriquecidas con esferas foron analizadas mediante SDS-PAGE e transferidas a membranas de PVDF (Millipore, #ISEQ00010) mediante métodos de transferencia Western estándar.As membranas foron bloqueadas con leite desnatado ao 5% (Sangon, #A600669) en TBS que contén 0,1% de tween-20 (TBST) e incubáronse secuencialmente con anticorpos primarios e secundarios.Os anticorpos primarios diluíronse 1:1000 en leite desnatado ao 5% en TBST e incubáronse durante a noite a 4 °C.Utilizáronse anticorpos secundarios nunha proporción de 1:5000 e incubáronse durante 1 hora a temperatura ambiente.As membranas foron visualizadas por quimioluminiscencia usando o sistema de imaxe Chemidoc MP.Todas as exploracións sen cortar de manchas e xeles da figura preséntanse como datos brutos.
Os anticorpos primarios utilizados neste estudo incluíron o anticorpo monoclonal anti-SFPQ de coello (CST, no 71992), o anticorpo monoclonal anti-FUS de coello (CST, no 67840), o anticorpo policlonal anti-NSUN2 de coello (Proteintech, no 20854-1-). AP), anticorpo policlonal anti-mSin3A de coello (Abcam, #ab3479), anticorpo monoclonal anti-etiqueta de rato (TransGen, #HT201-02), anticorpo monoclonal anti-β-actina de rato (TransGen, #HC201-01), anti-coello - Anticorpo monoclonal CDK2 (ABclonal, #A0094), anticorpo monoclonal de coello contra CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorpo policlonal de coello contra DUT (ABclonal, #A2901), anticorpo policlonal de coello contra PSMC4 (ABclonal, #A2505), anti- Anticorpo policlonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Estes anticorpos utilizáronse nunha dilución 1:1000 en leite desnatado ao 5% en TBST.Os anticorpos secundarios utilizados neste estudo incluíron IgG anti-coello (TransGen, #HS101-01), IgG anti-rato (TransGen, #HS201-01) nunha dilución 1:5000.
Para investigar aínda máis se BRD4 interactúa con SFPQ, colocáronse células estables HEK293T e BRD4-miniSOG que sobreexpresan HEK293T en pratos de 10 cm.As células laváronse con PBS frío e lisáronse en 1 ml de tampón de lise Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) con inhibidor de protease libre de EDTA durante 30 minutos a 4 °C.Despois diso, os lisados foron recollidos en tubos de centrífuga de 1,5 ml e centrifugados a 15.871 xg durante 10 min a 4 °C.O sobrenadante recolleuse e incubouse con 5 µg de anticorpo monoclonal de rato marcado anti-V5 (CST, #80076) durante a noite a 4°C.Lave aproximadamente 50 µl de perlas magnéticas de proteína A/G (MCE, #HY-K0202) dúas veces con PBS que conteña 0,5% de Tween-20.Despois, os lisados celulares incubáronse con perlas magnéticas durante 4 horas a 4 °C con rotación de abaixo cara arriba.A continuación, laváronse catro veces as esferas con 1 ml de tampón PBST e fervíronse a 95 °C durante 5 min.As mostras foron analizadas en xeles SDS-PAGE e transferidas a membranas de PVDF mediante métodos de transferencia Western estándar.As membranas bloqueáronse en leite desnatado ao 5% en TBST e incubáronse secuencialmente con anticorpos primarios e secundarios.Anticorpo primario Anticorpo monoclonal anti-SFPQ de coello (CST, #71992) utilizouse nunha proporción de 1:1000 en leite desnatado ao 5% en TBST e incubouse durante a noite a 4 °C.Utilizouse IgG anti-coello nunha proporción de 1:5000 e incubouse durante 1 hora a temperatura ambiente.As membranas foron visualizadas por quimioluminiscencia usando o sistema de imaxe Chemidoc MP.
Todas as estruturas utilizadas para a análise da área de superficie accesible ao disolvente (SASA) obtivéronse do Protein Data Bank (PDB)52 ou da AlphaFold Protein Structure Database53.O SASA absoluto calculouse para cada residuo mediante o programa FreeSASA.Só se utilizaron datos SASA completos e inequívocos para a histidina marcada e os seus veciños para obter a SASA media para cada estrutura.A accesibilidade relativa ao disolvente (RSA) para cada histidina calculouse dividindo o valor absoluto de SASA pola superficie empírica máxima posible do residuo dispoñible para o disolvente.Todas as histidinas clasificáronse entón como ocultas se a RSA media estaba por debaixo do 20%, en caso contrario expostas56.
Os ficheiros en bruto obtidos no modo DDA foron buscados mediante Proteome Discoverer (v2.5) ou MSfragger (Fragpipe v15.0) na base de datos de proteínas verificada SwissProt adecuada que contén contaminantes comúns.Os péptidos requirían tripsina completa con dous sitios de escisión ausentes, a metilación do carbamoílo como modificación fixa e a oxidación da metionina como modificación dinámica.As tolerancias de peso de precursores e fragmentos establecéronse en 10 ppm e 0,02 Da (MS2 Orbitrap), respectivamente. Elimináronse os golpes de contaminantes e filtráronse as proteínas para obter unha taxa de descubrimento falso <1%. Elimináronse os golpes de contaminantes e filtráronse as proteínas para obter unha taxa de descubrimento falso <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полуби полуфи 1%. Elimináronse os golpes de contaminantes e filtráronse as proteínas para dar unha taxa de detección falsa <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены %1. Elimináronse os golpes de contaminantes e filtráronse as proteínas para conseguir unha taxa de falsos positivos <1%.Para a análise cuantitativa sen o uso de etiquetas, utilizouse o contido de proteína normalizado de tres repeticións biolóxicas.A análise de localización subcelular de proteínas realizouse mediante análise de Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 e bases de datos compiladas e publicadas polo grupo Alice Ting.O mapa do volcán foi obtido de Perseo (v1.6.15.0). Probáronse os cambios de dobra da abundancia de proteínas para determinar a significación estatística mediante unha proba t de dúas caras, e identificáronse os acertos de proteínas cun cambio de abundancia > 2 (a non ser que se indique o contrario) e un valor p <0,05. Probáronse os cambios de dobra da abundancia de proteínas para determinar a significación estatística mediante unha proba t de dúas caras, e identificáronse os acertos de proteínas cun cambio de abundancia > 2 (a non ser que se indique o contrario) e un valor p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Probáronse os cambios de dobra do contido de proteínas para determinar a significación estatística mediante unha proba t de dúas colas e identificáronse as coincidencias de proteínas cun cambio de contido > 2 (a non ser que se indique o contrario) e un valor ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 确定 蛋白质 中 的 丰度 变化 变化> 2 （除非 另 说明）） 和 和 值使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 命 的 丰度 变化> 2 （另 说明）） 和 和 值 值 值））） 和 和 值 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Probouse a significación estatística dos cambios de pregamento no contido de proteína mediante unha proba t de dúas colas e determináronse as coincidencias de proteínas para os cambios de contido > 2 (a non ser que se indique o contrario) e os valores p <0,05.A análise da interacción das proteínas realizouse mediante a análise GO xunto coa base de datos String.
Realizáronse tres réplicas biolóxicas con resultados similares.A análise estatística realizouse con GraphPad Prism (software GraphPad) e xeráronse gráficos de volcáns con Perseus (v1.6.15.0).Para comparar os dous grupos, os valores p determináronse mediante a proba t de Student de dúas colas.Só as proteínas singleton identificadas polo menos dúas veces no grupo experimental foron incluídas nas parcelas de volcáns, e os correspondentes valores que faltan no grupo control foron substituídos por Perseus dunha distribución normal para que se puidese calcular o valor p.As barras de erro representan a media ± desviación estándar.Nas análises proteómicas para análise estatística, mantívose a abundancia de proteínas que apareceron en polo menos dúas réplicas biolóxicas.Non se utilizaron métodos estatísticos para predeterminar o tamaño da mostra.Os experimentos non son aleatorios.Os investigadores non estaban cegos ás tarefas durante o experimento e a avaliación dos resultados.
Para obter máis información sobre o deseño do estudo, consulte o resumo do informe de investigación da natureza vinculado a este artigo.
Os datos de espectrometría de masas obtidos neste estudo foron enviados ao ProteomeXchange Consortium a través do repositorio de socios iProX57 baixo o ID do conxunto de datos PXD034811 (conxunto de datos PDPL-MS).Os datos en bruto ofrécense en forma de ficheiros de datos en bruto.Este artigo ofrece os datos orixinais.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Coñecendo o barrio: utilizando a biotinilación dependente da proximidade para caracterizar complexos proteicos e mapear orgánulos. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Coñecendo o barrio: utilizando a biotinilación dependente da proximidade para caracterizar complexos proteicos e mapear orgánulos.Gingras, AS, Abe, KT e Raut, B. Familiaridade co contorno: utilizando a biotinilación dependente da proximidade para caracterizar complexos proteicos e mapear orgánulos. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Comprender o barrio: utilizar a dependencia do barrio da vida biolóxica.Gingras, AS, Abe, KT e Raut, B. Comprensión da proximidade: caracterización de complexos proteicos e mapeamento de orgánulos mediante a biotinilación dependente da proximidade.Actual.A miña opinión.Química.bioloxía 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mapeo do microambiente mediante a transferencia de enerxía de Dexter ás células inmunes.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.As redes de escala de dous proteomas detectan a remodelación específica da célula do interactoma humano.Celas 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Hora de publicación: 15-09-2022
