Novas

As estratexias diagnósticas tradicionais para detectar enfermidades infecciosas requiren o uso de instrumentos de mesa que non son axeitados para as probas no punto de atención (POCT).A microfluídica emerxente é unha tecnoloxía altamente miniaturizada, automatizada e integrada que é unha alternativa potencial aos métodos tradicionais para realizar diagnósticos in situ rápidos, de baixo custo e precisos.Os métodos de diagnóstico molecular son amplamente utilizados en dispositivos microfluídicos como os métodos máis eficaces para a detección de patóxenos.Esta revisión resume os avances recentes no diagnóstico molecular de enfermidades infecciosas baseado en microfluídicos desde unha perspectiva académica e industrial.En primeiro lugar, describimos un procesamento típico en chip de ácidos nucleicos, incluíndo o pretratamento da mostra, a amplificación e a lectura do sinal.A continuación compáranse as características, vantaxes e inconvenientes dos catro tipos de plataformas microfluídicas.A continuación, comentaremos o uso de ensaios dixitais para a cuantificación absoluta de ácidos nucleicos.Os dispositivos de diagnóstico molecular baseados en microfluídicos, tanto clásicos como comerciais recentes, resúmense como evidencia do estado actual do mercado.Finalmente, propoñemos orientacións futuras para o diagnóstico microfluídico de enfermidades infecciosas.
As enfermidades infecciosas son causadas por patóxenos, incluíndo bacterias, virus e parasitos, que se distribúen por todo o mundo.A diferenza doutras enfermidades, os patóxenos inféctanse rapidamente e propáganse entre os humanos e os animais hóspedes a través da inoculación, o aire e os medios de auga [1].A prevención de enfermidades infecciosas é fundamental como medida de saúde pública.Tres estratexias principais para combater as enfermidades infecciosas: (1) controlar a fonte de infección;(2) interrupción da vía de transmisión;(3) protección das poboacións susceptibles.Entre as principais estratexias, o control da fonte de infección considérase a estratexia máis importante pola súa comodidade e baixo custo.O diagnóstico rápido, o illamento e o tratamento das persoas infectadas son fundamentais, xa que requiren estratexias de diagnóstico rápidas, sensibles e precisas [2].O diagnóstico actual de enfermidades infecciosas adoita combinar o exame clínico baseado en signos e síntomas e estudos de laboratorio, como cultivo celular e diagnóstico molecular, que requiren persoal capacitado, procedementos intensivos en man de obra e equipos de proba caros [3, 4].A prevención de brotes de enfermidades infecciosas require un diagnóstico local rápido, barato e preciso, especialmente en áreas de recursos limitados onde as enfermidades infecciosas son comúns e graves [5], así como tratamento no deserto ou no campo de batalla, onde as emerxencias son imprevisibles..a atención médica é limitada [6].Neste contexto, a microfluídica é unha tecnoloxía que combina tecnoloxías de sistemas microelectromecánicos, nanotecnoloxía ou ciencia de materiais para a manipulación precisa de fluídos [7,8,9,10], proporcionando novas posibilidades para a detección no punto de atención (POCT).) axentes infecciosos fóra dos hospitais e laboratorios.En comparación cos diagnósticos tradicionais que consumen moito tempo, a tecnoloxía microfluídica ofrece mostras e aforro de custos para o diagnóstico molecular durante os brotes de enfermidades.A propagación global da enfermidade por coronavirus 2019 (COVID-19) é causada pola síndrome respiratoria aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2), polo que se subliña de novo a importancia da microfluídica para a prevención e control oportunos da pandemia [11, 12]. , 13].A diferenza dos diagnósticos tradicionais, o POCT microfluídico usa pequenos dispositivos portátiles que van desde analizadores de mesa ata pequenas tiras de proba lateral para probar preto do punto de mostraxe [14].Estas probas presentan unha preparación simple ou sen mostras, unha rápida amplificación do sinal e lecturas de sinal sensibles que dan como resultado resultados de curta duración e precisos en poucos minutos.A dispoñibilidade e produción en masa de instrumentos sanitarios baseados en microfluídicos ampliaron as súas aplicacións de diagnóstico directo e rendibles fóra do hospital, preto do paciente e mesmo na casa.
Entre as estratexias existentes para diagnosticar enfermidades infecciosas, o diagnóstico molecular é un dos máis sensibles [15, 16].Ademais, o diagnóstico molecular úsase a miúdo como patrón de ouro para a detección continua de COVID-19, permitindo a detección directa de rexións específicas de ARN ou ADN do virus antes do inicio dunha resposta inmune [17, 18].Na presente revisión, presentamos os últimos avances nos procesos de diagnóstico molecular baseados en microfluídica para enfermidades infecciosas, desde unha perspectiva académica ata perspectivas industriais futuras (Fig. 1).Comezaremos con tres pasos clave na detección de ácidos nucleicos: pretratamento da mostra no chip, amplificación de ácidos nucleicos e lectura de sinal.Despois comparamos diferentes tipos de plataformas microfluídicas coa súa estrutura e función, mostrando características únicas (fortalezas e debilidades).A detección dixital de ácidos nucleicos é máis discutida e dáse como exemplo dunha tecnoloxía de terceira xeración para a cuantificación absoluta de moléculas de patóxenos infecciosos.Ademais, presentaranse varios dispositivos POCT comerciais típicos e máis recentes para demostrar o estado actual do mercado POCT microfluídico para diagnóstico molecular.Tamén discutiremos e explicaremos a nosa visión para futuras aplicacións.
Os módulos de chips microfluídicos para a detección de ácidos nucleicos pódense dividir en tres categorías (mostraxe, recoñecemento e sinalización) segundo as súas funcións [19].Entre estes módulos, o módulo de mostraxe realiza principalmente a lise de mostras e a extracción de ácidos nucleicos.O módulo sensor controla principalmente a conversión e amplificación dos sinais de ácidos nucleicos.O módulo de sinalización detecta o sinal convertido e procesado polo módulo de detección.A partir do proceso de detección de ácidos nucleicos nun chip, resumiremos os distintos chips que poden realizar a función de "entrada e saída".
O primeiro paso na detección de ácidos nucleicos é a extracción de ácidos nucleicos, é dicir, illar o ácido nucleico diana da mostra orixinal.A extracción de ácidos nucleicos realízase para purificar os ácidos nucleicos doutros contaminantes moleculares, garantir a integridade da estrutura primaria das moléculas de ácidos nucleicos e optimizar os resultados.A extracción de ácidos nucleicos require a necesaria lise de mostras e captura de ácidos nucleicos, cuxa calidade e eficiencia teñen un gran impacto nos resultados da investigación e do diagnóstico.Calquera efecto secundario sutil durante a extracción pode limitar a detección adicional.Por exemplo, os métodos de reacción en cadea da polimerase (PCR) e de amplificación isotérmica en bucle (LAMP) inhiben algúns disolventes orgánicos residuais como o etanol e o isopropanol en reactivos de illamento de ácidos nucleicos [20].A extracción líquido-líquido e a extracción en fase sólida son os métodos máis populares para illar ácidos nucleicos [21], non obstante, a extracción líquido-líquido nun chip é extremadamente limitada, xa que os reactivos utilizados na extracción líquido-líquido causan a corrosión da maioría dos chips microfluídicos. .Aquí, destacamos os métodos de extracción en fase sólida baseados en microarrays e comparamos as súas vantaxes e inconvenientes.
O silicio é un material de substrato compatible cos ácidos nucleicos debido á súa biocompatibilidade, estabilidade e facilidade de modificación [22].É importante destacar que, cando se modifica con sílice ou outros materiais, este composto presenta propiedades para adsorber ácidos nucleicos cargados negativamente en condicións de pH baixo e alto nivel de sal mentres eluye con solucións de pH alto e baixo contido de sal.En base a este fenómeno, é posible purificar o ácido nucleico.
Utilizáronse varias formas de materiais a base de sílice para a extracción de ácidos nucleicos en microfluídicas, como perlas de sílice, po, filtros de microfibra e membranas de sílice [23, 24, 25, 26].Dependendo das propiedades do material, os materiais a base de silicio pódense utilizar nos microcircuítos de diferentes xeitos.Por exemplo, os gránulos de sílice, os po e os nanofiltros comerciais pódense simplemente colocar nos poros ou microcanles dos chips microfluídicos e axudar a extraer ácidos nucleicos das mostras [27, 28, 29].As membranas de sílice modificadas na superficie tamén se poden usar para purificar rapidamente o ADN de patóxenos a baixo custo.Por exemplo, Wang et al.[30] Ao combinar reaccións de amplificación desnaturalizantes con intercambio de cadeas mediado por vesículas con membranas de sílice recubertas con oligosacáridos de quitosano, introduciuse un sistema portátil versátil que detectou con éxito 102-108 unidades formadoras de colonias.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., e a presenza do virus era facilmente visible.Powell et al.[31] Despois utilizáronse micromatrices baseadas en silicio para detectar o virus da hepatite C (VHC), o virus da inmunodeficiencia humana (VIH), o virus Zika e o virus do papiloma humano e a propagación automática, no que se desenvolveu un microrreactor tortuoso de 1,3 μl para capturar virus de ARN.e realizar amplificación in situ.Ademais destes métodos, as microcolumnas de sílice modificadas na superficie tamén xogan un papel fundamental na extracción de ácidos nucleicos, xa que a xeometría e as propiedades do material modificador aumentan moito a eficiencia da extracción.Chen et al.[32] propuxo unha plataforma microfluídica para o illamento de ARN de baixa concentración baseada en microcolumnas de silicio revestidas de amino.Este dispositivo microfluídico integra unha matriz de micropilares de 0,25 cm2 nun substrato de silicio para conseguir unha maior eficiencia de extracción a través dun deseño de gran proporción entre superficie e volume.A vantaxe deste deseño é que o dispositivo microfluídico pode acadar ata o 95% de eficiencia de extracción de ácidos nucleicos.Estas estratexias baseadas en silicio demostran o valor de illar rapidamente os ácidos nucleicos a baixo custo.En combinación con chips microfluídicos, as estratexias de extracción baseadas en silicio non só poden aumentar a eficiencia da detección de ácidos nucleicos, senón que tamén facilitan a miniaturización e integración de dispositivos analíticos [20].
Os métodos de separación magnética usan partículas magnéticas para illar ácidos nucleicos en presenza dun campo magnético externo.As partículas magnéticas de uso común inclúen partículas magnéticas Fe3O4 ou γ-Fe2O3 recubertas de sílice, amino e carboxilo [33,34,35,36].A característica distintiva das partículas magnéticas en comparación cos métodos SPE baseados en silicio é a facilidade de manipulación e control con imáns externos.
Usando a interacción electrostática entre os ácidos nucleicos e a sílice, en condicións de sal alto e pH baixo, os ácidos nucleicos son adsorbidos na superficie das partículas magnéticas recubertas de sílice, mentres que en condicións de sal e pH alto, as moléculas pódense lavar. de novo..As perlas magnéticas recubertas de sílice permiten extraer ADN de mostras de gran volume (400 μL) mediante un movemento controlado magnéticamente [37].Como demostración, Rodríguez-Mateos et al.[38] utilizaron imáns sintonizables para controlar a transferencia de contas magnéticas a diferentes cámaras.A partir de partículas magnéticas recubertas de sílice, pódense extraer 470 copias/ml de ARN xenómico SARS-CoV-2 de mostras de augas residuais para a detección de transcrición inversa LAMP (RT-LAMP) e a resposta pódese ler en 1 hora.a simple vista (Fig. 2a).
Dispositivos baseados en materiais magnéticos e porosos.Diagrama conceptual do dispositivo microfluídico IFAST RT-LAMP para a detección de ARN SARS-CoV-2 (adaptado de [38]).b Microdispositivo centrífugo para dSPE de ácido nucleico de hisopo bucal (adaptado de [39]).c Concentrador de mostras autoalimentado integrado mediante unha tarxeta FTA® (adaptado de [50]).d Papel de filtro Fusion 5 modificado con quitosano (adaptado de [51]).SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo grave coronavirus 2, amplificación isotérmica mediada por bucle de transcrición inversa RT-LAMP, socios tecnolóxicos de buscadores de FTA, ácido nucleico de NA
As partículas magnéticas cargadas positivamente son ideais para unir a columna vertebral de fosfato dun ácido nucleico.A certa concentración de sal, os grupos fosfato cargados negativamente dos ácidos nucleicos poden cargarse positivamente na superficie das partículas compostas magnéticas.Por iso, desenvolvéronse nanopartículas magnéticas cunha superficie rugosa e unha alta densidade de grupos amino para a extracción de ácidos nucleicos.Despois da separación e o bloqueo magnéticos, as nanopartículas magnéticas e os complexos de ADN pódense usar directamente na PCR, o que elimina a necesidade de operacións de purificación e elución complexas e que levan moito tempo [35].Tamén se utilizaron nanopartículas magnéticas recubertas con grupos carboxilo negativos para separar ácidos nucleicos adsorbidos en superficies en solucións de polietilenglicol e cloruro de sodio de alta concentración [36].Con estas perlas magnéticas modificadas na superficie, a extracción de ADN é compatible coa amplificación posterior.Dignan et al.[39] describiu unha plataforma microfluídica centrífuga automatizada e portátil para o pretratamento de ácidos nucleicos, que permite que o persoal non técnico poida usala no lugar.Ademais, a compatibilidade do ADN illado con LAMP, un método moi axeitado para a análise de ácidos nucleicos no punto de atención, demostra aínda máis os requisitos mínimos de equipamento e a idoneidade para os ensaios colorimétricos (Fig. 2b).
Os métodos de perlas magnéticas ofrecen a posibilidade de extracción automatizada, algunhas das cales existen nos extractores de ácidos nucleicos automatizados comerciais [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, EUA), QIAcube® HT;CapitalBio (Pequín, China) e Biomek®;Beckman (Miami, EUA).), Florida, EUA).As vantaxes de combinar esferas magnéticas con microfluídicas pódense utilizar para unha extracción automatizada eficiente de ácidos nucleicos, o que potencialmente podería avanzar no desenvolvemento do diagnóstico molecular;porén, a combinación de esferas magnéticas con microfluídicas aínda depende en gran medida de complexos sistemas de control para a manipulación precisa de esferas magnéticas, o que explica que a popularidade dos produtos comerciais sexan voluminosos e caros, o que limita a posterior aplicación de esferas magnéticas en POCT.
Tamén se utilizaron varios materiais porosos como filtros de nitrocelulosa modificada, tarxetas Finders Technology Associates (FTA), papeis de filtro a base de polietersulfona e materiais revestidos de glicanos para a detección de ácidos nucleicos [40, 41, 42, 43, 44].Os materiais fibrosos porosos, como o papel fibroso, utilizáronse primeiro para illar o ADN enredando fisicamente moléculas de ADN de cadea longa con fibras.Os poros pequenos levan a unha forte restrición física das moléculas de ADN, o que afecta positivamente á extracción do ADN.Debido aos diferentes tamaños de poros do papel fibroso, a eficiencia da extracción non pode satisfacer as necesidades de amplificación do ADN [45, 46].A tarxeta FTA é un papel de filtro comercial utilizado no campo da medicina forense e moi utilizado noutras áreas do diagnóstico molecular.Mediante o uso de papel de filtro de celulosa impregnado con varios produtos químicos para lisar as membranas celulares da mostra, o ADN liberado está protexido da degradación durante ata 2 anos.Máis recentemente, desenvolveuse papel de celulosa impregnada para a detección molecular de varios patóxenos, incluíndo SARS-CoV-2, leishmaniose e malaria [47,48,49].O VIH no plasma illado lisase directamente e o ácido nucleico viral enriquécese na membrana de fluxo FTA® integrada no concentrador, o que permite unha produción eficiente do ácido nucleico [50] (Fig. 2c).O principal problema coa detección de ácidos nucleicos mediante tarxetas FTA é que produtos químicos como a guanidina e o isopropanol inhiben as reaccións de amplificación posteriores.Para resolver este problema, desenvolvemos o papel de filtro Fusion 5 modificado con quitosano, que combina as vantaxes tanto do entrelazado físico de moléculas de ADN e papel de filtro fibroso como da adsorción electrostática de ADN en compostos modificados con quitosano para lograr unha extracción de ácido nucleico altamente eficiente. ..fibras filtrantes [51] (Fig. 2d).Do mesmo xeito, Zhu et al.[52] demostraron un método de PCR modificado con quitosano baseado nun sistema microfluídico capilar in situ para o illamento rápido e a detección do ARN do virus Zika.Os ácidos nucleicos pódense adsorber/desorber nun medio mixto de lisado/PCR, respectivamente, en función da propiedade do interruptor on/off do quitosano.on and off”, responde ao pH.
Como se mencionou anteriormente, estas estratexias combinan as vantaxes de varios materiais en fase sólida e aumentan a eficiencia da extracción de ácidos nucleicos en microfluídica.Nas aplicacións prácticas, o uso destes materiais en grandes cantidades é antieconómico, e o tratamento adecuado da superficie ou a modificación superficial de materiais comúns con estes materiais tamén poden preservar a súa función.Polo tanto, crese que a implantación destas estratexias tras un estudo piloto pode reducir custos.
As probas de ácidos nucleicos en plataformas microfluídicas a miúdo usan pequenos volumes de mostra (< 100 µl), polo que require a amplificación dos ácidos nucleicos diana con sondas específicas para a súa conversión a un sinal que sexa conveniente para a detección posterior (óptica, eléctrica e magnética) [53, 54]. As probas de ácidos nucleicos en plataformas microfluídicas a miúdo usan pequenos volumes de mostra (< 100 µl), polo que require a amplificación dos ácidos nucleicos diana con sondas específicas para a súa conversión a un sinal que sexa conveniente para a detección posterior (óptica, eléctrica e magnética) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Cando se proban ácidos nucleicos en plataformas microfluídicas, úsanse a miúdo pequenos volumes de mostra (<100 µL), polo que é necesaria a amplificación dos ácidos nucleicos diana con sondas especiais para convertelo nun sinal conveniente para a súa posterior detección (óptica, eléctrica e magnética). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 ， ， 以 转换 为 便于 检测 （、 电学 和）） 的 信号 [53, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 （光学 、 电学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. A detección de ácidos nucleicos en plataformas microfluídicas adoita empregar pequenos volumes de mostra (<100 μl), o que require a amplificación dos ácidos nucleicos diana con sondas especiais para convertelos en sinais para a súa posterior detección (óptica, eléctrica e magnética) [53, 54]] .A amplificación de ácidos nucleicos en microfluídica tamén pode acelerar as reaccións, optimizar os límites de detección, reducir os requisitos de mostra e mellorar a precisión da detección [55, 56].Nos últimos anos, coa realización dunha detección rápida e precisa, aplicáronse varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos en microfluídica, incluíndo a PCR e algunhas reaccións de amplificación isotérmica.Esta sección resumirá os métodos para a detección de ácidos nucleicos baseados en sistemas microfluídicos.
A PCR é unha simulación do proceso de replicación do ADN dun organismo, cuxa teoría se describe en detalle noutro lugar e non se discutirá aquí.A PCR pode amplificar unha cantidade moi pequena de ADN/ARN diana a unha velocidade exponencial, o que fai que a PCR sexa unha ferramenta poderosa para a detección rápida de ácidos nucleicos.Nas últimas décadas, desenvolvéronse moitos dispositivos microfluídicos portátiles equipados con sistemas de ciclo térmico de PCR para satisfacer as necesidades de diagnóstico no punto de atención [57, 58].A PCR en chip pódese dividir en catro tipos (PCR convencional, de fluxo continuo, con conmutación espacial e convectiva) segundo diferentes métodos de control de temperatura [59].Por exemplo, Gee et al.[60] desenvolveron un método de PCR cuantitativa de transcrición inversa directa (RT-qPCR) na súa propia plataforma microfluídica para a detección múltiple de virus SARS-CoV-2, gripe A e B en mostras de hisopos de garganta (Fig. 3a).Park et al.[61] construíu un chip de análise de patóxenos sinxelo integrando PCR de película fina, electrodos e un módulo microfluídico baseado en polidimetilsiloxano operado co dedo.Non obstante, ambos os traballos encarnan as deficiencias comúns da PCR convencional.A PCR require un ciclo térmico, o que limita a miniaturización do dispositivo e reduce o tempo de proba.
O desenvolvemento de PCR microfluídica e con conmutación espacial baseada en fluxo continuo é fundamental para resolver este problema.Usando unha canle serpentina longa ou unha canle recta curta, a PCR de fluxo continuo pode proporcionar unha amplificación rápida facendo circular activamente os reactivos en tres zonas de precalentamento cunha bomba sen chip.Esta operación evita con éxito a fase de transición entre diferentes temperaturas de reacción e, polo tanto, reduce significativamente o tempo de proba [62] (Fig. 3b).Noutro estudo de Jung et al.[63] propuxo un novo analizador xenético de PCR rotativo que combina as características da PCR fixa e de fluxo para a PCR de transcrición inversa ultrarrápida e múltiple (Fig. 3c).Para a amplificación do ácido nucleico, o microchip da PCR xirarase a través de tres bloques de calefacción a diferentes temperaturas: 1. Bloque de desnaturalización a 94 °C, 2. Bloque de recocido a 58 °C, 3. Bloque de expansión a 72 °C.
Aplicación da PCR en microfluídica.Representación esquemática de dirRT-qPCR nunha plataforma microfluídica (adaptado de [60]).b Representación esquemática dun microarray de PCR de fluxo continuo baseado nunha canle serpentina (adaptado de [62]).c Representación esquemática dun analizador xenético de PCR rotativo, composto por un microchip, tres bloques de calefacción e un motor paso a paso (adaptado de [63]).d Diagrama de PCR de termoconvección con centrifugación e configuración (adaptado de [64]).DirRT-qPCR, reacción en cadea de polimerase de transcrición inversa cuantitativa directa
Usando capilares e bucles ou incluso placas delgadas, a PCR por convección pode amplificar rapidamente os ácidos nucleicos mediante convección térmica libre natural sen necesidade dunha bomba externa.Por exemplo, desenvolveuse unha plataforma microfluídica de polímero de olefina cíclica nunha etapa de quecemento rotativa fabricada que usa ciclos térmicos con centrifugación nunha microcanle de bucle de PCR [64] (Fig. 3d).A solución de reacción é impulsada pola convección térmica, que intercambia continuamente alta e baixa temperatura nunha microcanle cunha estrutura anular.Todo o proceso de amplificación pódese completar en 10 minutos cun límite de detección de 70,5 pg/canle.
Como era de esperar, a PCR rápida é unha poderosa ferramenta para os sistemas de análise molecular e de análise múltiple de resposta á mostra totalmente integrados.A PCR rápida reduce significativamente o tempo necesario para detectar o SARS-CoV-2, o que contribúe ao control eficaz da pandemia de COVID-19.
A PCR require un termociclador complexo que non é adecuado para POCT.Máis recentemente, aplicáronse técnicas de amplificación isotérmica á microfluídica, incluíndo, entre outras, a LAMP, a amplificación da polimerase recombinase (RPA) e a amplificación baseada en secuencias de ácidos nucleicos [65,66,67,68].Con estas técnicas, os ácidos nucleicos amplifícanse a unha temperatura constante, facilitando a creación de dispositivos POCT portátiles de baixo custo e altamente sensibles para diagnóstico molecular.
Os ensaios LAMP baseados en microfluídica de alto rendemento permiten a detección múltiple de enfermidades infecciosas [42, 69, 70, 71].En combinación cun sistema microfluídico centrífugo, LAMP pode facilitar aínda máis a automatización da detección de ácidos nucleicos [69, 72, 73, 74, 75].O SlipChip spin-and-react foi desenvolvido para a detección visual de múltiples bacterias paralelas usando LAMP [76] (Fig. 4a).Ao usar LAMP optimizada no ensaio, a relación sinal-ruído de fluorescencia era de aproximadamente 5 veces e o límite de detección alcanzou 7,2 copias/μl de ADN xenómico. Ademais, a existencia de cinco patóxenos bacterianos dixestivos comúns, incluíndo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, visualizáronse en base ao método en < 60 min. Ademais, a existencia de cinco patóxenos bacterianos dixestivos comúns, incluíndo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, visualizáronse en base ao método en < 60 min.Ademais, a presenza de cinco patóxenos bacterianos comúns do tracto dixestivo, incluíndo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis e Vibrio parahaemolyticus, visualizouse mediante este método en menos de 60 minutos.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 肠杆菌 肠 氏 菌 、 河流 和 和 副溶血性此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 弧菌 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPAdemais, a presenza de cinco patóxenos gastrointestinais bacterianos comúns, incluíndo Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius e Vibrio parahaemolyticus, visualizouse mediante este método en menos de 60 minutos.
As vantaxes da LAMP en microfluídica inclúen, entre outras, a resposta rápida e a detección miniaturizada.Non obstante, debido á temperatura de reacción (ao redor de 70 °C), os aerosois xéranse inevitablemente durante a LAMP, o que resulta nunha alta taxa de falsos positivos.A especificidade do ensaio, o deseño do cebador e o control da temperatura tamén deben optimizarse para LAMP.Ademais, os deseños de chips que implementan a detección de múltiples obxectivos nun único chip son de gran valor e deberían desenvolverse.Ademais, LAMP é axeitado para a detección multipropósito integrada nun chip, o que é de gran importancia, pero aínda hai moito espazo para o desenvolvemento.
A alta taxa de falsos positivos de LAMP pode reducirse en parte con RPA, xa que a temperatura de reacción relativamente baixa (~37 °C) resulta en relativamente poucos problemas de evaporación [77].No sistema RPA, dous cebadores opostos inician a síntese de ADN uníndose a unha recombinase e a amplificación pódese completar en 10 minutos [78,79,80,81].Polo tanto, todo o proceso RPA é moito máis rápido que PCR ou LAMP.Nos últimos anos, demostrouse que a tecnoloxía microfluídica mellora aínda máis a velocidade e a precisión do RPA [82,83,84].Por exemplo, Liu et al.[85] desenvolveu un ensaio de amplificación da recombinase da polimerase de fluxo lateral integrado microfluídico para a detección rápida e sensible do SARS-CoV-2 integrando a RPA de transcrición inversa (RT-RPA) e un sistema universal de detección de tiras de proba de fluxo lateral.nun único sistema microfluídico.Figura 4b).O límite de detección é de 1 copia/µl ou 30 copias/mostra, e a detección pódese completar nuns 30 minutos.Kong et al.desenvolveron un dispositivo microfluídico portátil.[86] utilizou a temperatura corporal e un sistema de detección de fluorescencia baseado en teléfonos móbiles para detectar rápida e directamente o ADN do VIH-1 mediante RPA (Figura 4c).O ensaio RPA portátil detecta 100 copias/ml da secuencia diana en 24 minutos, demostrando un gran potencial para o diagnóstico rápido de bebés infectados polo VIH-1 en contextos de recursos limitados.
Amplificación isotérmica en probas de punto de atención (POCT).Desenvolvemento e produción de SlipChip de espín e reacción.Despois da soldadura por plasma, as virutas superior e inferior foron ensambladas cun conxunto de porcas para formar o chip final (adaptado de [76]).b Esquema do sistema MI-IF-RPA para a detección de COVID-19 (adaptado de [85]).c Esquema dunha proba RPA portátil para a detección rápida do ADN do VIH-1 (adaptado de [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxifluoresceína, virus da inmunodeficiencia humana VIH, RPA recombinase polimerase amplification, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Low Integrated Microfluteridic Polimerase Recombinase Amplificación
O RPA baseado en microfluídicos está a desenvolverse rapidamente, non obstante, o custo da fabricación de chips e o consumo de reaccións é demasiado alto e debe reducirse para aumentar a dispoñibilidade desta tecnoloxía.Ademais, a alta sensibilidade do RPA pode afectar á amplificación de produtos non específicos, especialmente en presenza de contaminación.Estas limitacións poden afectar a aplicación de RPA en sistemas microfluídicos e merecer unha optimización adicional.Tamén son necesarios cebadores e sondas ben deseñados para varias dianas para mellorar a viabilidade das estratexias microfluídicas baseadas en RPA en POCT.
Cas13 e Cas12a teñen a capacidade de escindir aleatoriamente ácidos nucleicos e, polo tanto, pódense desenvolver como ferramentas de detección e diagnóstico.Cas13 e Cas12a actívanse ao unirse ao ADN ou ARN diana, respectivamente.Unha vez activada, a proteína comeza a escindir outros ácidos nucleicos próximos, despois de que os ARN guía dirixidos a ácidos nucleicos específicos de patóxenos poden escindir sondas fluorescentes extinguidas e liberar fluorescencia.Baseándose nesta teoría, Kellner et al.[87] desenvolveu un método baseado en Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], e Broughton et al.[88] desenvolveu outro enfoque baseado en Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
Nos últimos anos apareceron varios métodos para a detección de ácidos nucleicos baseados en CRISPR [89, 90].Os métodos convencionais baseados en CRISPR adoitan levar moito tempo e moito traballo debido a múltiples procedementos que inclúen a extracción de ácidos nucleicos, a amplificación e a detección de CRISPR.A exposición de líquidos ao aire pode aumentar a probabilidade de resultados falsos positivos.Tendo en conta o anterior, os sistemas baseados en CRISPR necesitan unha gran necesidade de optimización.
Desenvolveuse unha plataforma microfluídica controlada pneumáticamente que pode realizar 24 análises en paralelo para aplicacións de detección CRISPR-Cas12a e CRISPR-Cas13a [91].O sistema está equipado cun dispositivo de detección de fluorescencia que evita a amplificación do ácido nucleico e detecta automaticamente mostras de ADN e ARN femtomolar.Chen et al.[92] integrou a amplificación da recombinase co sistema CRISPR-Cas12a en microfluídica centrífuga (Fig. 5a).Este traballo supera a dificultade de integrar estes dous procesos porque Cas12a pode dixerir o ADN mensaxeiro e inhibir o proceso de amplificación.Ademais, Chen et al.[92] ademais pre-almacenaron os reactivos de reacción nun control microfluídico centrífugo para completar automaticamente todo o proceso.Noutro traballo, Silva et al.[93] desenvolveu un método de diagnóstico sen amplificación CRISPR/Cas12a e un teléfono intelixente para detectar SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Este ensaio, coñecido como sistema libre de amplificación baseado en teléfonos móbiles, inclúe un encima dependente de CRISPR/Cas que se basea na visualización de sinais de burbullas xerados pola catalasa en canles microfluídicos por teléfonos intelixentes.Detección sensible de menos de 50 copias/µl de ácido nucleico sen amplificación previa, todo o proceso desde a inxección da mostra ata a lectura do sinal leva só 71 minutos.
Métodos de detección de ácidos nucleicos baseados en CRISPR.POCT centrífugo para diagnóstico molecular integrado baseado en CRISPR (adaptado de [92]).b Desenvolvemento da proba CASCADE para a análise do SARS-CoV-2 baseada en teléfonos intelixentes (adaptado de [93]).Amplificación da recombinase RAA, motivo de protoespaciador adxacente PAM, repeticións palindrómicas curtas agrupadas CRISPR a intervalos regulares, sistema CASCADE sen amplificación do teléfono móbil con encimas dependentes de CRISPR/CAS, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida EDC
Como último paso na detección de ácidos nucleicos, a detección de sinais reflicte directamente os resultados do diagnóstico e é un factor crítico no desenvolvemento dun POCT eficiente, sensible e preciso.Os sinais pódense ler mediante diversos métodos como estratexias fluorescentes, electroquímicas, colorimétricas e magnéticas.Nesta sección, describimos o fundamento de cada enfoque e comparamos os diagnósticos moleculares de enfermidades infecciosas en microfluídica.
As estratexias baseadas na fluorescencia úsanse amplamente para o diagnóstico POCT de enfermidades infecciosas debido ás súas notables vantaxes de excelente sensibilidade, baixo custo, facilidade de operación e análise no punto de atención [94, 95].Estas estratexias usan fluoróforos marcados como colorantes fluorescentes e nanomateriais para crear un sinal detectable (mellora ou extinción da fluorescencia).Este achado suxire que as estratexias baseadas na fluorescencia poden dividirse en etiquetaxe fluorescente directa, detección de fluorescencia activada e desactivada [96].A detección directa de etiquetas fluorescentes usa etiquetas fluorescentes especiais para marcar ligandos específicos que xeran unha cantidade específica de fluorescencia cando se unen selectivamente a un obxectivo.Para a detección de fluorescencia baseada en sinal, a calidade do sinal fluorescente está positivamente relacionada coa magnitude de interese.A intensidade da fluorescencia é insignificante en ausencia dun obxectivo e é detectable cando hai unha cantidade suficiente de obxectivo.Pola contra, a intensidade da fluorescencia detectada pola fluorescencia "desactivada" é inversamente proporcional á cantidade de obxectivo, alcanzando inicialmente un valor máximo e diminuíndo gradualmente a medida que o obxectivo se agranda.Por exemplo, usando o mecanismo de trans-clivaxe dependente da diana CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] desenvolveu unha nova estratexia de recoñecemento para detectar os ARN que evitan a transcrición inversa directamente (Fig. 6a).Tras unirse a ARN diana complementarios, o complexo CRISPR-Cas13-ARN pódese activar, provocando a clivaxe transcolateral por ARN informadores non específicos.O indicador marcado fluorescente [fluoróforo (F)] é extinguido polo extintor (Q) intacto e fluoresce cando o escinde polo complexo activado.
A vantaxe da detección electroquímica é a alta velocidade de detección, fácil produción, baixo custo, fácil de transportar e control automático.É un método analítico poderoso para aplicacións POCT.Baseado en transistores de efecto de campo de grafeno Gao et al.[98] desenvolveu un nanobiosensor para a detección múltiple de antíxenos da enfermidade de Lyme procedentes da bacteria Borrelia burgdorferi cun límite de detección de 2 pg/ml (Fig. 6b).
Os ensaios colorimétricos utilizáronse en aplicacións POCT, beneficiándose das vantaxes da portabilidade, o baixo custo, a facilidade de preparación e a lectura visual.A detección colorimétrica pode usar a oxidación de peroxidase ou nanomateriais similares á peroxidase, a agregación de nanomateriais e a adición de colorantes indicadores para converter a información sobre a presenza de ácidos nucleicos obxectivo en cambios de cor visibles [99, 100, 101].En particular, as nanopartículas de ouro úsanse amplamente no desenvolvemento de estratexias colorimétricas e, debido á súa capacidade para inducir cambios de cor rápidos e significativos, hai un interese crecente no desenvolvemento de plataformas colorimétricas POCT para o diagnóstico in situ de enfermidades infecciosas [102].Cun dispositivo microfluídico centrífugo integrado [103], os patóxenos transmitidos por alimentos en mostras de leite contaminado pódense detectar automaticamente a nivel de 10 células bacterianas, e os resultados pódense ler visualmente en 65 minutos (Fig. 6c).
As técnicas de detección magnética poden detectar con precisión os analitos mediante materiais magnéticos, e nas últimas décadas houbo un importante interese nas aplicacións POCT.As técnicas de detección magnética teñen algunhas vantaxes únicas, como materiais magnéticos de baixo custo en lugar de compoñentes ópticos caros.Non obstante, o uso dun campo magnético mellora a eficiencia da detección e reduce o tempo de preparación da mostra [104].Ademais, os resultados da sonda magnética demostran unha alta especificidade, sensibilidade e alta relación sinal-ruído debido ao sinal de fondo magnético insignificante das mostras biolóxicas [105].Sharma et al.integrou un biosensor baseado en unión de túnel magnético nunha plataforma de microchip portátil.[106] para a detección múltiple de patóxenos (Fig. 6d).Os biosensores detectan sensiblemente ácidos nucleicos subnanomolares illados de patóxenos.
Método típico de detección de sinal.O concepto de detección hiperlocalizada de Cas13a (adaptado de [97]).b Nanobiosensor FET de grafeno en combinación con Lyme GroES scFv (adaptado de [98]).c Indicacións colorimétricas para a detección múltiple de patóxenos transmitidos por alimentos nun chip microfluídico centrífugo: mostras no 1 e no 3 con patóxenos diana, e mostras no 2, no 4 e no 5 sen patóxenos diana (adaptado de [103]) .d Biosensor baseado nunha unión de túnel magnético, que inclúe unha plataforma, un amplificador de bloqueo incorporado, unha unidade de control e unha fonte de alimentación para a xeración/adquisición de sinal (adaptado de [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimeticona, PMMA polimetilmetacrilato
A pesar das excelentes características dos métodos de detección anteriores, aínda teñen desvantaxes.Compáranse estes métodos (táboa 1), incluíndo algunhas aplicacións con detalles (pros e contras).
Co desenvolvemento da microfluídica, sistemas microelectromecánicos, nanotecnoloxía e ciencia de materiais, o uso de chips microfluídicos para a detección de enfermidades infecciosas avanza constantemente [55,96,107,108].A manipulación precisa de equipos e fluídos en miniatura contribúe á precisión do diagnóstico e á rendibilidade.Polo tanto, para un maior desenvolvemento, fixéronse esforzos para optimizar e actualizar os chips, dando como resultado varios chips microfluídicos con diferentes estruturas e funcións.Aquí presentamos brevemente varios tipos comúns de plataformas microfluídicas e comparamos as súas características (pros e contras).Ademais, a maioría dos exemplos que se enumeran a continuación céntranse principalmente na loita contra o SARS-CoV-2.
Os LOCC son os sistemas analíticos complexos miniaturizados máis comúns e as súas operacións están moi miniaturizadas, integradas, automatizadas e paralelizadas desde a inxección e preparación de mostras, o control de fluxo e a detección de líquidos [109, 110].Os líquidos son manipulados mediante unha xeometría coidadosamente deseñada e a interacción de moitos efectos físicos como gradientes de presión, acción capilar, electrodinámica, campos magnéticos e ondas acústicas [111].LOCC mostra excelentes vantaxes na selección de alto rendemento e na detección múltiple, cunha velocidade de análise rápida, un tamaño de mostra pequeno, un baixo consumo de enerxía e unha alta eficiencia de xestión e operación;con todo, os dispositivos LOCC son moi delicados, e a fabricación, embalaxe e interface.Non obstante, a multiplexación e a reutilización enfróntanse a enormes dificultades [96].En comparación con outras plataformas, LOCC ten vantaxes únicas en canto á máxima diversidade de aplicacións e mellor compatibilidade tecnolóxica, pero tamén son obvias as súas desvantaxes, a saber, a alta complexidade e a pouca repetibilidade.A dependencia de bombas externas, que adoitan ser voluminosas e caras, limita aínda máis o seu uso en POCT.
Durante o brote de COVID-19, LOCC recibiu moita atención.Ao mesmo tempo, hai varios novos chips que combinan varias tecnoloxías.Por exemplo, agora os teléfonos intelixentes úsanse amplamente como dispositivos de análise portátiles e teñen un gran potencial para a integración de LOCC.Sun et al.[21] fabricou un chip microfluídico que permite multiplexar secuencias específicas de ácidos nucleicos de cinco patóxenos, incluído o SARS-CoV-2, usando LAMP e analizounos usando un teléfono intelixente dentro dunha hora despois do final da reacción.Como outro exemplo, Sundah et al.[112] creou un interruptor molecular [amplificación catalítica mediante interruptor de estado de transición molecular (CATCH)] para a detección directa e sensible de dianas de ARN do SARS-CoV-2 mediante teléfonos intelixentes. CATCH é compatible con LOCC portátil e alcanza un rendemento superior (aproximadamente 8 copias de ARN/μl; < 1 h a temperatura ambiente) [112]. CATCH é compatible con LOCC portátil e alcanza un rendemento superior (aproximadamente 8 copias de ARN/μl; < 1 h a temperatura ambiente) [112]. Catch совместим с портативныы locc и оеспечивает пеевосходню прззводитель <<<1 пеерне]. CATCH é compatible con LOCC portátil e proporciona un excelente rendemento (aproximadamente 8 copias de ARN/µl; < 1 h a temperatura ambiente) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 Catch совместим с портативныы locc и и обладает превосходной производительностюю (пиере 8 зâоопопâн <<1 чеерйâеен а <ч <<1 че <1 че <1 ч <<1 ч <<1 ч <<1 ч << CATCH é compatible con LOCC portátiles e ten un excelente rendemento (aproximadamente 8 copias de ARN/µl; < 1 hora a temperatura ambiente) [112].Ademais, os dispositivos LOCC para diagnóstico molecular tamén usan algunhas forzas impulsoras como o baleiro, o estiramento e os campos eléctricos.Kang et al.[113] demostrou unha PCR de nanoplasma nun chip ultrarrápida en tempo real para o diagnóstico rápido e cuantitativo de COVID-19 no campo mediante un chip de PCR líquida plasmónica ao baleiro.Li et al.[114] desenvolveu posteriormente un chip microfluídico impulsado por estiramento que permitiu o diagnóstico de COVID-19.A plataforma utiliza o sistema de amplificación RT-LAMP para determinar se unha mostra é cualitativamente positiva ou negativa.Posteriormente, Ramachandran et al.[115] conseguiron gradientes de campo eléctrico apropiados mediante isotacoforese (ITP), unha técnica de enfoque selectivo de ións implementada en microfluídica.Con ITP, o ARN obxectivo de mostras de hisopo nasofarínxeo en bruto pódese purificar automaticamente.Entón Ramachandran et al.[115] Ao combinar esta purificación de ITP con ensaios LAMP e CRISPR mellorado con ITP detectou o SARS-CoV-2 en cotonete nasofarínxeo humano e en mostras clínicas nuns 35 minutos.Ademais, están xurdindo novas ideas constantemente.Jadhav et al.[116] propuxo un esquema de diagnóstico baseado na espectroscopia Raman mellorada en superficie en combinación cun dispositivo microfluídico que contén nanotubos de carbono revestidos de ouro/prata orientados verticalmente ou micro/nanotubos desbotables.Os microcanles de filtro incorporados funcionalizados con membrana son desbotables.O dispositivo adsorbe virus de varios fluídos/exsudados corporais, como saliva, nasofarinxe e bágoas.Así, o título do virus é abundante e o virus pódese identificar con precisión pola sinatura Raman.
LOAD é unha plataforma microfluídica centrífuga na que todos os procesos están controlados por un protocolo de frecuencia que fai xirar un substrato microestructurado [110].O dispositivo LOAD caracterízase por utilizar a forza centrífuga como unha forza motriz importante.Os líquidos tamén están suxeitos ás forzas capilares, de Euler e de Coriolis.Usando un dispositivo de centrífuga, as análises realízanse en operación líquida continua desde unha posición radial cara a dentro cara a fóra, eliminando a necesidade de tubos, bombas, actuadores e válvulas activas externas adicionais.En resumo, un único método de control simplifica a operación.As forzas que actúan sobre o líquido na mesma canle microfluídica á mesma distancia do centro de carga son iguais, o que permite repetir a estrutura da canle.Así, os equipos LOAD son máis sinxelos e económicos de deseñar e fabricar que os equipos LOCC convencionais, mentres que as reaccións son en gran parte independentes e paralelizadas;con todo, debido á alta resistencia mecánica dos equipos centrífugos, o material de chip dispoñible é limitado e os pequenos volumes son difíciles.ao coche.Ao mesmo tempo, a maioría dos dispositivos LOAD están deseñados para un só uso, o que é caro para a detección a gran escala [96, 117, 118, 119].
Nas últimas décadas, LOAD, considerado un dos dispositivos microfluídicos máis prometedores, recibiu unha considerable atención por parte de investigadores e fabricantes.Así, LOAD gañou unha ampla aceptación e utilizouse para o diagnóstico molecular de patóxenos infecciosos [120, 121, 122, 123, 124], especialmente durante o brote de COVID-19.Por exemplo, a finais de 2020, Ji et al.[60] demostrou un ensaio directo de RT-qPCR para a detección paralela rápida e automatizada de infeccións por SARS-CoV-2 e gripe A e B en mostras de hisopos de garganta.Entón Xiong et al.[74] presentou unha plataforma microfluídica discoide integrada con LAMP para a detección rápida, precisa e simultánea de sete coronavirus respiratorios humanos, incluído o SARS-CoV-2, en 40 minutos.A principios de 2021, de Oliveira et al.[73] demostrou un chip microfluídico centrífugo de tóner de poliestireno, operado manualmente cun rotador da punta dos dedos, para o diagnóstico molecular de RT-LAMP de COVID-19.Posteriormente, Dignan et al.[39] presentou un microdispositivo de centrífuga portátil automatizado para a purificación de ARN SARS-CoV-2 directamente a partir de seccións de hisopo bucal.Medved et al.[53] propuxo un sistema de mostraxe de aerosois SARS-CoV-2 en liña cun chip fluorescente microfluídico rotativo de pequeno volume cun límite de detección de 10 copias/μL e un limiar de ciclo mínimo de 15 minutos.Suárez et al.[75] informou recentemente do desenvolvemento dunha plataforma microfluídica centrífuga modular integrada para a detección directa de ARN SARS-CoV-2 en mostras de hisopo nasofarínxeo inactivadas por calor mediante LAMP.Estes exemplos demostran os grandes beneficios e a promesa de LOAD no diagnóstico molecular de COVID-19.
En 1945 Muller e Clegg [125] presentaron por primeira vez canles microfluídicos en papel usando papel de filtro e parafina.En 2007, o grupo Whitesides [126] creou a primeira plataforma de papel funcional para probas de proteínas e glicosa.O papel converteuse nun substrato ideal para a microfluídica.O papel ten propiedades inherentes como hidrofilia e estrutura porosa, excelente biocompatibilidade, peso lixeiro, flexibilidade, pregabilidade, baixo custo, facilidade de uso e comodidade.Os µPAD clásicos consisten en estruturas hidrófilas/hidrófobas construídas sobre substratos de papel.Dependendo da estrutura tridimensional, os μPAD pódense dividir en μPAD bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D).Os µPAD 2D prodúcense formando límites hidrófobos para formar canles microfluídicos, mentres que os µPAD 3D adoitan facerse a partir de pilas de capas de papel microfluídico 2D, ás veces mediante dobrado de papel, técnicas de deslizamento, canles abertos e impresión 3D [96].Os fluídos acuosos ou biolóxicos do μPAD son controlados principalmente pola forza capilar sen unha fonte de enerxía externa, o que facilita o almacenamento previo dos reactivos, a manipulación de mostras e a detección múltiplex.Non obstante, o control de fluxo preciso e a detección múltiplex vense obstaculizado pola velocidade de detección, a sensibilidade e a reutilización insuficientes [96, 127, 128, 129, 130].
Como unha plataforma microfluídica inusual, o μPAD foi amplamente promovido e desenvolvido para o diagnóstico molecular de enfermidades infecciosas como o VHC, o VIH e o SARS-CoV-2 [131, 132].Para a detección selectiva e sensible do VHC, Tengam et al.[133] desenvolveu un novo biosensor baseado en papel fluorescente utilizando unha sonda de ácido nucleico moi específica baseada no péptido pirrolidinilo.Os ácidos nucleicos están inmobilizados covalentemente sobre papel de celulosa parcialmente oxidado por alquilación redutiva entre grupos amino e grupos aldehídos, e a detección baséase na fluorescencia.Estes sinais poden ser lidos por un gadget especialmente feito cunha cámara fluorescente portátil en combinación cunha cámara de teléfono móbil.Posteriormente, Lu et al.[134] deseñou un electrodo flexible baseado en papel baseado en compostos de armazón organometálico de nanopartículas de níquel/ouro/nanotubos de carbono/alcohol polivinílico para a detección de dianas do VIH mediante hibridación de ADN utilizando azul de metileno como indicador redox de ADN.Máis recentemente, Chowdury et al.[135] presentou un deseño hipotético de plataforma para probas de µPAD no punto de atención usando saliva cruda do paciente en combinación con LAMP e tecnoloxía de imaxe portátil para a detección de analitos COVID-19.
As probas de fluxo lateral guían os fluídos por forzas capilares e controlan o movemento dos fluídos pola mollabilidade e as características dos substratos porosos ou microestruturados.Os dispositivos de fluxo lateral consisten en mostra, conxugado, incubadora e detección e almofadas absorbentes.As moléculas de ácido nucleico no LFA recoñecen aglutinantes específicos que se almacenan previamente no lugar de unión e únense como complexos.A medida que o líquido pasa polas placas de incubación e detección, os complexos son capturados polas moléculas de captura situadas nas liñas de proba e control, mostrando resultados que se poden ler directamente a simple vista.Normalmente, o LFA pódese completar en 2-15 minutos, o que é máis rápido que o descubrimento tradicional.Debido ao mecanismo especial, LFA require poucas operacións e non require equipos adicionais, o que o fai moi fácil de usar.É doado de fabricar e miniaturizar, e o custo dos substratos baseados en papel é menor.Non obstante, só se usa para análise cualitativa, e a detección cuantitativa é moi difícil e a capacidade de multiplexación e o rendemento son moi limitados, e só se pode detectar un ácido nucleico suficiente á vez [96,110,127].
Aínda que a maioría das aplicacións de LFA están centradas nos inmunoensaios, o uso de LFA para diagnóstico molecular en chips microfluídicos tamén é eficaz e popular [136].No caso do virus da hepatite B, VIH e SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] propuxo unha plataforma LFA de nanopartículas de conversión superior e demostrou a versatilidade desta plataforma miniaturizada e portátil mediante a detección sensible e cuantitativa de múltiples dianas como o ácido nucleico do VHB.Ademais, Fu et al.[138] demostrou un novo LFA baseado na espectroscopia Raman mellorada na superficie para a análise cuantitativa do ADN do VIH-1 a baixas concentracións.Para a detección rápida e sensible do SARS-CoV-2, Liu et al.[85] desenvolveu unha análise de fluxo lateral RPA integrado con microfluídicos combinando RT-RPA e un sistema universal de detección de fluxo lateral nun único sistema microfluídico.
A aplicación de varias plataformas microfluídicas varía en función dos estudos específicos, aproveitando ao máximo as capacidades e vantaxes das plataformas.Con válvulas, bombas e condutos accesibles, LOCC é a plataforma máis completa para a diversidade de aplicacións e a interoperabilidade con maior espazo para o desenvolvemento.Por iso, esperamos e recomendamos que os estudos máis novos se realicen no LOCC como primeiro intento e que se optimicen as condicións.Ademais, espérase que no sistema se descubran e utilicen métodos máis eficientes e precisos.LOAD destaca no control preciso dos fluídos dos dispositivos LOCC existentes e demostra vantaxes únicas en unidades únicas mediante forza centrífuga sen necesidade de unidades externas, mentres que as respostas paralelas poden ser separadas e sincronizadas.Así, no futuro, LOAD converterase na principal plataforma microfluídica con menos operacións manuais e tecnoloxías máis maduras e automatizadas.A plataforma µPAD combina os beneficios do LOCC e os materiais baseados en papel para diagnósticos de baixo custo e de uso único.Polo tanto, o desenvolvemento futuro debe centrarse en tecnoloxías convenientes e ben establecidas.Ademais, o LFA é moi axeitado para a detección a simple vista, prometendo reducir o consumo de mostras e acelerar a detección.Na táboa 2 móstrase unha comparación detallada de plataformas.
As análises dixitais dividen a mostra en moitos microrreactores, cada un dos cales contén un número discreto de moléculas diana [139, 140].Os ensaios dixitais ofrecen vantaxes significativas para realizar a cuantificación absoluta ao realizar miles de experimentos bioquímicos paralelos de forma simultánea e individual en compartimentos a escala de micras en lugar de nunha fase continua.En comparación coa microfluídica tradicional, as reaccións de compartimentos poden reducir o volume da mostra, aumentar a eficiencia da reacción e integrarse facilmente con outros métodos analíticos sen necesidade de canles, bombas, válvulas e deseños compactos [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].En ensaios dixitais utilízanse os dous métodos seguintes para conseguir unha separación uniforme e precisa das solucións, incluíndo reactivos e mostras como células, ácidos nucleicos e outras partículas ou moléculas: (1) emulsións de caer que aproveitan a inestabilidade da interface líquida;(2) a división da matriz realízase polas restricións xeométricas do dispositivo.No primeiro método, as gotículas que conteñen reactivos e mostras en microcanles pódense crear mediante métodos pasivos como co-corrente, fluxo cruzado, foco de fluxo, emulsificación por etapas, emulsificación de microcanles e membranas mediante forzas de cizallamento viscosas e emulsificación con cambio de canle.localización [143, 145, 146, 148, 149] ou mediante métodos activos [150, 151], que introducen enerxía adicional a través do control eléctrico, magnético, térmico e mecánico.Neste último enfoque, a mellor uniformidade de volume de fluído nas cámaras microfluídicas compártese mantendo estruturas espaciais do mesmo tamaño, como microfosas e matrices de superficie [152,153,154].En particular, as gotículas son grandes seccións de fluxo que tamén se poden xerar e manipular en matrices de electrodos baseadas en microfluídica dixital (DMF).A electrohumectación dos dieléctricos é unha das teorías DMF mellor estudadas, xa que a electrohumectación dos dieléctricos permite a manipulación precisa das gotas individuais, controlando a forma do líquido e os sinais eléctricos asimétricos que pasan por diferentes lados [141, 144].As principais operacións con gotículas en DMF inclúen a clasificación, división e fusión [151, 155, 156], que se poden aplicar en varios campos de análise, especialmente na detección molecular [157, 158, 159].
A detección dixital de ácidos nucleicos é unha tecnoloxía de diagnóstico molecular de terceira xeración que segue a PCR convencional e a PCR cuantitativa en tempo real (qPCR), en paralelo coa secuenciación de alto rendemento e a biopsia líquida.Nas últimas dúas décadas, os ácidos nucleicos dixitais desenvolvéronse rapidamente no campo do diagnóstico molecular de patóxenos infecciosos [160, 161, 162].A cuantificación absoluta da detección dixital de ácidos nucleicos comeza co empaquetado de mostras e reactivos en compartimentos individuais para garantir que cada secuencia diana teña a mesma probabilidade de entrar en cada compartimento individual.Teoricamente, a cada sección pódeselle asignar varias secuencias diana, ou pode que non exista un sistema de microreacción independente.A través dos distintos mecanismos de detección descritos anteriormente, os compartimentos con secuencias diana microbianas que xeran sinais por riba dun determinado limiar pódense visualizar a simple vista ou mediante unha máquina e son etiquetados como positivos, mentres que outros compartimentos que xeran sinais por debaixo do limiar están etiquetados como positivos. .negativos, que fan que o sinal de cada sección sexa booleano.Así, calculando o número de compartimentos creados e a taxa de resultados positivos despois da reacción, as copias orixinais das mostras de proba pódense comparar mediante a fórmula de distribución de Poisson sen necesidade dunha curva estándar, que é necesaria para análises cuantitativas rutineiras como como qPCR.[163] En comparación cos métodos tradicionais de diagnóstico molecular, a detección dixital de ácidos nucleicos ten un maior grao de automatización, maior velocidade de análise e sensibilidade, menos reactivos, menos contaminación e un deseño e fabricación máis sinxelos.Por estes motivos, o uso de ensaios dixitais, especialmente métodos baseados en gotas, para diagnóstico molecular, que combinan técnicas de amplificación e lectura de sinal, foi ben estudado durante o brote crítico de SARS-CoV-2.Por exemplo, Yin et al.[164] combinou métodos dixitais de gotas e PCR rápida para detectar os xenes ORF1ab, N e RNase P no SARS-CoV-2 nun chip microfluídico.En particular, o sistema foi capaz de identificar un sinal positivo en 115 segundos, o que é máis rápido que a PCR convencional, o que indica a súa eficacia na detección no punto de atención (Figura 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] e Alteri et al.[167] tamén aplicou a PCR dixital en gotas (ddPCR) para detectar SARS-CoV-2 nun sistema microfluídico con resultados impresionantes.Para mellorar aínda máis a taxa de detección, Shen et al.[168] logrou imaxes con chip baseadas en ddPCR en tan só 15 segundos sen utilizar técnicas de unión de imaxes, acelerando o proceso da tecnoloxía ddPCR desde o laboratorio ata a aplicación.Non só se aplican métodos de amplificación térmica como a PCR, senón que tamén se utilizan métodos de amplificación isotérmica para simplificar as condicións de reacción e a resposta rápida.Lu et al.[71] desenvolveu SlipChip para a análise de gotas, capaz de xerar gotas de varios tamaños a altas densidades nun só paso e cuantificar os ácidos nucleicos SARS-CoV-2 usando LAMP dixital (Figura 7b).Como tecnoloxía en rápida evolución, CRISPR tamén pode desempeñar un papel importante na detección dixital de ácidos nucleicos mediante imaxes colorimétricas convenientes sen necesidade de manchas adicionais de ácidos nucleicos.Ackerman et al.desenvolveu unha reacción matricial combinatoria para a avaliación múltiple de ácidos nucleicos.[158] detectou 169 virus asociados a humanos, incluído o SARS-CoV-2, en gotículas que conteñen reactivos de detección de ácidos nucleicos baseados en CRISPR-Cas13 nun ensaio de micropozos (Figura 7c).Ademais, a amplificación isotérmica e a tecnoloxía CRISPR pódense utilizar nun mesmo sistema para combinar as vantaxes de ambas.Park et al.[169] Desenvolveuse un ensaio dixital CRISPR/Cas12a nun chip microfluídico comercial para a detección de SARS-CoV-2 extraído e destruído por calor baseado nun RT-RPA dunha etapa cunha detección de sinal a fondo máis curta e maior. relación de tempo., rango dinámico máis amplo e mellor sensibilidade (Fig. 7d).Algunhas descricións destes exemplos aparecen na táboa 3.
Plataforma dixital típica para a detección de ácidos nucleicos.a O fluxo de traballo de PCR dixital rápida consta de catro pasos clave: preparación da mostra, distribución da mestura de reacción, proceso de amplificación e cuantificación da diana (adaptado de [164]).b Esquema que mostra a análise de gotículas SlipChip para a formación de gotas a alta densidade (adaptado de [71]).c Diagrama de fluxo de traballo CARMEN-Cas13 (adaptado de [158]).d Visión xeral da detección dixital avanzada de virus con CRISPR/Cas nun só recipiente (adaptado de [169]).W/O auga en aceite, PDMS de polidimetilsiloxano, reacción en cadea da polimerasa PCR, recollida de datos DAQ, derivado integral proporcional PID, reacción de matriz combinatoria CARMEN para a avaliación múltiple de ácidos nucleicos, SARS-CoV-2, síndrome respiratorio agudo grave, coronavirus 2, RT Amplificación da transcriptase inversa recombinase polimerase-RPA, sinal S/B en segundo plano